兩株植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌生長的影響

胡慧琳，戴靖，劉彩琴*，陸胤，謝廣發，毛青鐘，鄭連寶

1(浙江樹人學院 生物與環境工程學院，浙江 杭州，310015)2(會稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)3(德清縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 湖州，313200)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)是黃酒自然浸米工藝中存在的乳酸菌[1]，在長期的生產實踐中發現，相同工藝、相同底物發酵濃度釀成的紹興黃酒，因浸米時間不同(傳統攤飯法釀酒，浸米時間長達16～26 d，機械化黃酒生產時浸米時間縮短至2～5 d)，其貯藏期不一致，浸米時間長釀得的酒，入壇后能夠久藏不壞，反之則不易久藏，有人認為與浸米過程中微生物及代謝產物息息相關[2]。黃酒浸米過程中乳酸菌屬為優勢細菌，其豐度含量占60.67%，其中乳桿菌屬含量占乳酸菌的90%，而植物乳桿菌占57.4%，短乳桿菌占21.1%，浸米后期，植物乳桿菌占比達90%，而短乳桿菌幾乎不存在[3-4]。短乳桿菌的消失是否與植物乳桿菌有關，目前研究報道較少。

另一方面，植物乳桿菌和短乳桿菌的代謝產物對黃酒的品質和風味有較大影響。一類代謝產物是有機酸類，這類物質與黃酒的回味、柔和性、濃厚感和愉悅感有關[4-5]；另一類代謝產物是生物胺，有研究表明：生物胺含量過高會引起人體血管、動脈和微血管的擴大，導致高血壓、頭疼，腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等不良反應[6-7]，酒類飲品中生物胺含量過高是飲后“上頭”的主要原因之一[8]。短乳桿菌所產生的酸有明顯的惡臭味，使人產生不愉快的感覺，而植物乳桿菌所產的酸味比較清爽[5]；同時植物乳桿菌代謝產生生物胺較低[5,9]。由此看來，黃酒發酵過程中應盡量控制短乳桿菌，而在不引入外源抑制劑，憑借共生系統中的一些微生物或者代謝產物來抑制其生長或破壞其完整的細胞，可提升黃酒品質。

為此，本研究以從黃酒浸米水中分離得到2株植物乳桿菌，即R1和R2，為實驗菌株，探討植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌生長情況、細胞內外無機磷和ATP的影響，為后續黃酒加工工藝優化和黃酒品質提升提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis) AS1.12，浙江省微生物研究所；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)R1(CCTCC M 2019007)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)R2(CCTCC M 2019008)，武漢大學工業微生物保藏中心。

1.1.2 試劑

MRS培養基、瓊脂粉，杭州微生物試劑有限公司；CaCO3，成都市科龍化工試劑廠。

乙酸乙酯，上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇，天津市永大化學試劑有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ATP含量測定盒、磷(Pi)測試盒(磷鉬酸法)，南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器

分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；YM30Z滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；酶標儀，美國熱電Multiskanmk 3；恒溫培養振蕩器，濟南歐萊博技術有限公司。

1.1.4 培養基

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌斜面培養基[10]：含0.3%(質量分數)CaCO3的MRS(deMan,Rogosa and Sharpe)固體培養基。

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌活化培養基：MRS液體培養基。

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌保藏培養基：含2%瓊脂粉的MRS固體培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌發酵粗提液制備

參照崔天琦等[11]的方法略有改動。將植物乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養基，在37 ℃培養24 h，發酵液以8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液。將上清液與乙酸乙酯以1∶1體積比混合，置室溫下以180 r/min在搖床上振蕩2 h；后將混合溶液倒入干燥的分液漏斗中靜置，待分層明顯后取出上層有機相及乳化層于無菌錐形瓶中，將得到的有機相在45 ℃下旋轉蒸發，除去乙酸乙酯，得植物乳桿菌發酵粗提液。

1.2.2 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌抑菌活性的檢測

1.2.2.1 牛津杯法

參考都立輝等[12]的方法。以短乳桿菌作為指示菌，取適量植物乳桿菌發酵粗提液進行2倍稀釋，取樣200 μL進行抑菌實驗，抑菌活性按公式(1)計算：

(1)

式中：n，對短乳桿菌有抑菌效果的最大稀釋倍數；V，牛津杯內的加樣體積，μL。

1.2.2.2 平板計數法

用接種環挑取短乳桿菌單菌落于MRS液體培養基，在37 ℃恒溫培養24 h。將50 mL短乳桿菌發酵液在4 ℃、3 000 r/min離心5 min，用無菌鹽水洗滌2次并重懸于10 mL鹽水中，采用10倍等比稀釋法將短乳桿菌菌懸液梯度稀釋至10-1、10-3、10-5。用0.9%生理鹽水將R1、R2的發酵粗提液稀釋至質量分數為25%。取10-1、10-3、10-5的短乳桿菌菌懸液200 μL，與等體積、質量分數為25%的R1、R2發酵粗提液混合，后均勻涂布于培養基表面，以生理鹽水為對照組。將平板倒置于37 ℃恒溫培養24 h。

1.2.3 短乳桿菌生長曲線的測定

將對數生長期的短乳桿菌和經0.20 μm濾膜除去雜菌、活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發酵粗提液按1∶2的體積比加入96孔板中，37 ℃孵育12 h，每隔1 h記錄600 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。對照組中加入與上述體積對應的短乳桿菌和生理鹽水，每組設3個平行。

1.2.4 短乳桿菌細胞裂解率的測定

參照楊鵬斌等[13]的方法略作修改。取培養24 h短乳桿菌發酵液50 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，將沉淀用0.03 mol/L、pH 6.5的K3PO4緩沖液洗滌2次，沉淀重懸于10 mL K3PO4緩沖液。將50 μL短乳桿菌懸液和100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發酵粗提液加入96孔板，37 ℃培養12 h，每隔1 h測定650 nm處的吸光度，以加入等比例蒸餾水為對照。設置3個平行，試驗數據用平均值表示，細胞裂解率按公式(2)計算：

(2)

式中：A0，0 h的吸光度；At，1～12 h的吸光度。

1.2.5 短乳桿菌細胞內、外無機磷濃度的測定

參考周偉等[14]方法。將對數生長期的短乳桿菌以6 000 r/min離心10 min，取沉淀，用2.5 mmol/L HEPES并且含有10 mmol/L的葡萄糖的緩沖液(pH 7.0)反復洗滌2次，制成108CFU/L的菌懸液，備用。

吸取上述菌懸液每份2 mL，加入100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發酵粗提液，每隔15 min終止反應。0 ℃、10 000 r/min離心7 min，取上清液，用磷測試盒在660 nm處測定短乳桿菌胞外無機磷的濃度。

短乳桿菌用1 mL的5%(體積分數)三氯乙酸充分懸浮菌體沉淀，-20 ℃下冷凍過夜。解凍后，95 ℃條件下溫育10 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液，用磷測試盒在660 nm處測定短乳桿菌胞內無機磷的濃度。

1.2.6 短乳桿菌細胞內、外ATP濃度的測定

取108CFU/L的短乳桿菌菌懸液每份2 mL，加入100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發酵粗提液，每隔15 min終止反應，0 ℃、10 000 r/min離心7 min；取上清液，按ATP含量試劑盒說明書在636 nm處測定細胞外ATP的濃度[15]；同時，用細胞破碎儀將沉淀破碎后離心，上清液用于測定細胞內ATP的含量。

1.2.7 數據處理

所有的實驗數據均為3個重復的平均值，數據經Origin 2018分析和處理。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌的抑菌活性

含有短乳桿菌的培養基中，按牛津杯法加入植物乳桿菌R1和R2發酵粗提液的孔周圍沒有菌生長，形成明顯的抑菌圈，說明短乳桿菌的生長完全被抑制(圖1)，而對照孔周圍沒有抑菌圈。將表1數據帶入公式(1)計算得植物乳桿菌R1和R2發酵粗提液菌對短乳桿菌的抑菌活性分別為160和320 AU/mL。

1-R1粗提液；2-R2粗提液a-平板正面；b-平板反面圖1 植物乳桿菌粗提液對短乳桿菌的抑菌實驗Fig.1 Antibacterial activity of fermentation crude extract of L.plantarum on L.brevis

表1 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌的抑菌作用Table 1 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on L.brevis

平板計數法實驗結果見圖2。加入植物乳桿菌R1和R2發酵粗提液后，稀釋度為10-3和10-5的短乳桿菌不生長，稀釋度為10-1時，加入R1發酵粗提液的平板上有少量短乳桿菌生長，而R2發酵粗提液完全抑制了短乳桿菌的生長。

a-稀釋度為10-1;b-稀釋度為10-3;c-稀釋度為10-5圖2 植物乳桿菌R1和R2發酵粗提液對短乳桿菌生長的影響Fig.2 Effect of L.plantarum R1 and R2 crude fermentation extracts on the growth of L.brevis注：從左到右依次為：短乳桿菌、短乳桿菌+R1發酵粗提液、短乳桿菌+R2發酵粗提液

2.2 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌生長曲線的影響

將對數期的短乳桿菌與植物乳桿菌發酵粗提液以1∶2的體積比混合，37 ℃培養12 h，短乳桿菌的生長曲線見圖3。

圖3 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on growth curve of L.brevis

從圖3可見，對照組在培養0～2 h時吸光度變化不大，培養2～10 h，吸光度增加，尤其在4～6 h時增幅最大，10～12 h吸光度下降；而短乳桿菌與植物乳桿菌發酵粗提液混合組在0～12 h吸光度變化幅度很小。說明植物乳桿菌發酵粗提液抑制了短乳桿菌的生長。

2.3 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌裂解率的影響

從圖4可見，在0～12 h，加入植物乳桿菌發酵粗提液組隨時間延長，致短乳桿菌裂解率增加，至12 h時，植物乳桿菌R1和R2致短乳桿菌細胞裂解率分別達到18.9%和20.1%；而未添加植物乳桿菌發酵粗提液的短乳桿菌裂解率總體呈負值，說明在實驗的0～12 h，短乳桿菌菌體一直處于增長態勢。可見植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌有裂解作用。這可能是浸米后期植物乳桿菌成優勢菌，而短乳桿菌幾乎不存在的原因。

圖4 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌裂解率的影響Fig.4 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on lysis rate of L.brevis

2.4 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌細胞內、外無機磷濃度的影響

由圖5可見，在植物乳桿菌發酵粗提液作用于短乳桿菌的90 min內，短乳桿菌胞內無機磷濃度隨時間增加而下降，胞外無機磷濃度隨時間增加而增高。植物乳桿菌R1發酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內無機磷濃度從0時的1.359 mmol/L下降到90 min的0.224 mmol/L；相應的，胞外無機磷濃度為從0.213 mmol/L上升到1.107 mmol/L。植物乳桿菌R2發酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內無機磷濃度從0時的2.056 mmol/L下降到90 min的0.455 mmol/L；相應的，胞外無機磷濃度從0.304 mmol/L上升到1.634 mmol/L。60 min后，短乳桿菌胞內ATP濃度幾乎不再改變，胞外ATP濃度變化幅度不大。說明植物乳桿菌發酵粗提液破壞了短乳桿菌細胞膜的完整性。該實驗結果與周偉等[14]報道的植物乳桿菌素L-1對單核細胞增生李斯特氏菌的研究結果相似，也與劉文婷等[16]報道的乳酸菌細菌素Lac-B23對熒光假單胞菌的研究結果相似。

圖5 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌胞內外無機磷濃度的影響Fig.5 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on intracellular and extracellular inorganic phosphorus concentration of L.brevis

2.5 植物乳桿菌R1發酵粗提液對短乳桿菌細胞內、外ATP濃度的影響

由圖6可見，在植物乳桿菌發酵粗提液作用于短乳桿菌的90 min時間內，短乳桿菌胞內ATP濃度隨時間增加而下降，胞外ATP濃度隨時間增加而增高。

圖6 植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌細胞內外ATP濃度的影響Fig.6 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on intracellular and extracellular ATP concentration of L.brevis

植物乳桿菌R1發酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內ATP濃度從0時的21.18 μmol/g Hb下降到90 min的4.82 μmol/g Hb；相應的，胞外ATP濃度從0上升到20.23 μmol/g Hb。植物乳桿菌R2發酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內ATP濃度從0時的26.18 μmol/g Hb下降到90 min的4.62 μmol/g Hb；相應的，胞外ATP濃度從0 μmol/g Hb上升到23.40 μmol/g Hb。說明植物乳桿菌發酵粗提液對短乳桿菌細胞膜有破壞作用。而細胞內ATP降低，對細胞內依賴于ATP的反應造成了影響，從而抑制微生物生長繁殖[15]。劉文婷等[16]、趙瑞香等[17]和ZHAO等[18]研究結果也顯示細胞內ATP下降，胞外ATP濃度上升。

3 討論

植物乳桿菌和短乳桿菌是黃酒發酵過程中常見的微生物，兩者代謝產生的有機酸種類及含量差異較大，植物乳桿菌代謝產生乳酸、蘋果酸和不揮發酸的能力均優于短乳桿菌，而短乳桿菌產的乙酸、庚酸、正丁酸和異戊酸分別是植物乳桿菌的4、5、6、3倍左右；現有研究表明，乳酸口感柔和有濃厚感，可以緩沖和平衡黃酒對口腔的刺激作用，乳酸和琥珀酸是導致黃酒回味的主要物質；乙酸刺激感強并有揮發性，適口性較差，而異丁酸、庚酸和異戊酸帶有不愉悅的惡臭味[4-5]。從提高黃酒品質的角度來看，黃酒發酵過程中短乳桿菌含量越少越好，但是短乳桿菌是自然發酵情況下存在的微生物，不引入外源抑制劑，憑借共生系統中的一些微生物或者代謝產物能抑制其生長或破壞其完整的細胞，是比較恰當的處理方法。

本實驗研究結果表明，植物乳桿菌代謝產物能抑制短乳桿菌的生長，會造成短乳桿菌的裂解，導致其細胞內無機磷和ATP的泄露。本實驗結果為降低黃酒浸米過程中短乳桿菌提供了一條解決途徑。

此前有報道，某些植物乳桿菌的代謝產物能抑制鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特菌、白色念珠菌等[19-20]，也有些植物乳桿菌代謝產物能抑制黑曲霉、棒狀青霉、擴展青霉等真菌[21-22]；發揮抑菌功能的主要物質有抑菌肽(常被稱為細菌素)和有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸、苯乳酸等)[23-25]。關于其抑菌機制，常見的有細胞膜損傷機制和細胞壁損傷機制之說；代謝產物通過改變細胞膜的結構或損傷細胞膜，可導致膜透性發生改變或形成孔洞，細胞發生裂解，胞內容物如ATP、無機磷、Na+、K+等小分子物質大量流出；而能作用于細胞壁的物質，是依靠肽內酶切，致目標細菌細胞壁裂解[26-28]。從本實驗結果來看，植物乳桿菌R1和R2的發酵粗提液對短乳桿菌的細胞膜有影響，從而致其生長受阻。