雙醛纖維素納米晶Pickering乳液的制備及其釋放二氫楊梅素的研究

葛黎明，徐錦芳，穆暢道，李德富

(四川大學 化學工程學院，四川 成都，610065)

乳液是由2種互不相溶的液體構成的雙組分或多組分體系[1]。傳統以表面活性劑穩定的乳液是一種動力學穩定但熱力學不穩定的體系，其不僅易發生重力裂解、絮凝、聚結和奧氏熟化等問題會導致乳液破乳，而且存在表面活性劑用量大、毒性和環境污染等問題[2]。為了滿足綠色化學的理念和進一步拓寬乳液在醫藥、化妝品和食品等領域的應用，急需研究開發新型無毒安全的表面活性劑或表面活性劑類似物，以及探索開發熱力學穩定的新型乳液的方法和技術。國內外科研人員經過不懈努力成功研發出了一種以膠體粒子穩定的乳液——Pickering乳液。天然生物高分子納米顆粒常常被用于制備綠色環保的Pickering乳液[3-4]。生物高分子制備的Pickering乳液具有優良的聚結穩定性、負載能力、控釋性、安全性、生物降解性和生物相容性等優勢，可以彌補傳統乳液的缺點和不足[2, 5-6]。當前，Pickering乳液已被廣泛應用于化妝品、食品加工、生物醫藥、石油工業、農業及環境保護等領域。

纖維素納米晶(cellulose nanocrystalline，CNC)是剛性的棒狀晶體，可以從天然纖維素中水解得到[1,7]。CNC作為天然產物制備的納米材料，具有高結晶度、高比表面積、優異的表面化學反應性、良好的生物相容性和可生物降解性等優勢特性[8-9]。隨著材料科學的發展，CNC作為一種穩定有效的固體顆粒乳化劑的研究已引起了廣泛關注[1,10-11]。然而，在利用酸水解制備CNC的過程中，一些帶負電荷的官能團，如磺酸酯基會被引入到CNC表面。引入的負電荷通過靜電排斥作用以促進CNC在水溶液中懸浮穩定，但較高的靜電排斥力會導致CNC無法有效穩定Pickering乳液[12]。此外，CNC較強的親水特性極大地限制了其在Pickering乳液中的應用。通過表面活性劑吸附、氧化、醚化、胺化、酯化、硅烷化和聚合物接枝改性等方法調節CNC的親/疏水性以改善其表面潤濕性，可以有效增強CNC的乳化性能，進而提高乳液的穩定性[10,13-15]。因此，以改性CNC穩定的Pickering乳液作為載體，裝載活性物質以實現遞送和緩釋功能的研究意義重大。

二氫楊梅素(dihydromyricetin)是葡萄科蛇葡萄屬的一種木質藤本植物藤茶中的雙氫黃酮醇化合物[16]。二氫楊梅素作為一類比較特殊的天然黃酮類產物，具有降血糖、解酒護肝、抗褐變、抗腫瘤、消炎以及強大的抗氧化活性[17-18]。但是，二氫楊梅素存在水溶性較低、易發生氧化、生物半衰期短、膜滲透力差等缺點[19]。基于此，本研究旨在利用氧化改性的CNC制備穩定的Pickering乳液以實現對二氫楊梅素的負載和緩釋。首先采用硫酸水解纖維素制備得到CNC，然后采用高碘酸鈉氧化法將CNC分子中鄰位羥基特異性地氧化成醛基制得雙醛纖維素納米晶(dialdehyde cellulose nanocrystalline，DCNC)，之后以CNC和DCNC為乳化劑制備負載二氫楊梅素的Pickering乳液。探究制備工藝、鹽離子濃度、CNC和DCNC濃度、油水相體積比對制備的Pickering乳液的影響，獲得最佳工藝參數；研究最優工藝下制備的Pickering乳液的流變性能以及其對二氫楊梅素的釋放動力學。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-纖維素(≤25 μm)、高碘酸鈉(分析純，≥99.5%)、鹽酸羥胺(優級純，99%)和二氫楊梅素(色譜純，>97%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、濃H2SO4、HCl、NaOH和無水乙醇均為分析純，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultra Turrax T25高速均質乳化機，德國IKA公司；ST 16R高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；SCIENTZ-Ⅱ D超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；SPM-9600原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)，日本Shimadzu公司；FEI Talos F200S透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)，美國PerkinElmer公司；Nano-ZS ZEN3600激光粒度儀，英國Malvern公司；pH-100-DB800U-1PL光學顯微鏡，鳳凰光學集團有限公司；A360紫外分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；MCR302模塊化智能型旋轉流變儀，奧地利Anton Paar公司。

1.3 雙醛纖維素納米晶的制備及表征

1.3.1 CNC的制備

利用硫酸水解α-纖維素制備得到CNC。將4.50 g α-纖維素加入到90.0 mL質量濃度為600 g/L的硫酸溶液中，于45 ℃下攪拌反應2.5 h。然后向反應體系中加入90.0 mL去離子水以停止反應。將反應物在10 000 r/min下離心5 min，之后將沉淀分散于去離子水中，再次離心，重復操作4次。將沉淀裝入截留分子質量為8 000～12 000 Da的透析袋中，透析3～5 d至中性。最后補加去離子水，獲得質量濃度為20 g/L的CNC懸浮液。

1.3.2 DCNC的制備

采用高碘酸鈉氧化法制備DCNC。取50.0 mL質量濃度為20 g/L的CNC懸浮液，按NaIO4∶CNC質量比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5和1∶2分別添加NaIO4，調節混合液的pH至3.0。然后將混合液于40 ℃下避光攪拌反應4 h。之后將混合液于10 000 r/min下離心5 min，使用去離子水洗滌沉淀物5次，并將沉淀物透析3～5 d至無I-和IO3-殘留。最后補加適量的去離子水，獲得質量濃度為15 g/L的DCNC懸浮液。根據NaIO4添加量不同，將制備得到的DCNC分別命名為DCNC1、DCNC2、DCNC3和DCNC4。

1.3.3 CNC和DCNC的微觀形貌及Zeta電位表征

將CNC和DCNC懸浮液稀釋至1.0×10-4g/mL，超聲2 min。分別將10 μL稀釋液滴于新剝離的云母片和銅網上，干燥后使用AFM和TEM觀察CNC和DCNC的微觀形貌。將CNC和DCNC懸浮液稀釋至5.0 mg/mL，然后使用激光粒度儀測定其Zeta電位。測量溫度為25 ℃，平衡時間為2 min。重復測量3次，取其平均值為最終結果。

1.3.4 DCNC的醛基含量的測定

采用鹽酸羥胺滴定法測定DCNC的醛基含量[20]。取20.0 mL質量濃度為10 g/L的DCNC懸浮液，使用0.1 mol/L的鹽酸將其pH值調至3.20。將鹽酸羥胺溶于0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到濃度為0.72 mol/L的鹽酸羥胺溶液。然后將40.0 mL鹽酸羥胺溶液加入到DCNC懸浮液中，于40 ℃水下攪拌反應4 h。接著使用0.10 mol/L鹽酸滴定反應混合液至pH 3.20。使用質量濃度為10 g/L的CNC懸浮液作為空白對照組。DCNC的醛基含量由公式(1)計算得到，重復測量5次，取其平均值作為DCNC的醛基含量。

(1)

式中：V0,滴定空白對照組消耗的鹽酸溶液的體積，mL；Vs,滴定DCNC所消耗的鹽酸溶液的體積，mL；c,滴定時所用鹽酸的濃度，mol/L；m,DCNC的質量，g。

1.4 經DCNC穩定且負載二氫楊梅素的Pickering乳液的制備

1.4.1 制備工藝對Pickering乳液的影響

配制質量濃度為10 g/L的CNC懸浮液。然后向CNC懸浮液中加入NaCl，使其濃度達到50 mmol/L。設置如下操作工藝：(1)超聲(100 W, 15 min)分散CNC懸浮液；(2)冰浴下超聲(300 W, 2 min)以強力分散CNC懸浮液；(3)按照油水相體積比=0.4∶1加入大豆油于CNC懸浮液中，于14 000 r/min均質2 min；(4)冰浴下繼續超聲(300 W, 2 min)。通過結合不同的工藝，制備得到如下6組Pickering乳液。乳液a：(1)(2)(3)(4)；乳液b：(1)(2)(3)、乳液c：(1)(2)(4)；乳液d：(1)(3)(4)；乳液e：(1)(3)和乳液f：(1)(4)。

1.4.2 顆粒濃度對Pickering乳液的影響

配制質量濃度分別為5、10和15 g/L的CNC和DCNC懸浮液。然后向上述溶液中加入二氫楊梅素，得到質量濃度為20 g/L的二氫楊梅素/CNC和二氫楊梅素/DCNC懸浮液。以二氫楊梅素/CNC和二氫楊梅素/DCNC懸浮液為水相，大豆油為油相，控制油水相體積比=0.4∶1，根據1.4.1確定的最優工藝，制備得到Pickering乳液。將Pickering乳液命名為xCNC-0.4P或xDCNC-0.4P，其中x為水相中CNC或DCNC的質量濃度。

1.4.3 油水相比對Pickering乳液的影響

根據上述確定的最優工藝和最適顆粒濃度，調節油水相體積比為0.2∶1、0.4∶1和0.8∶1，制備得到不同的Pickering乳液。將Pickering乳液命名為xCNC-yP或xDCNC-yP，其中x為水相中CNC或DCNC的質量濃度，y為Pickering乳液的油水相比。

1.5 Pickering乳液的穩定性研究

1.5.1 儲存和離心穩定性

取5.0 mL新制備的Pickering乳液置于15 mL離心管中，于5 000 r/min下離心5 min，吸取出下層清液并量取體積，同時計算上層乳液體積。將制備得到的Pickering乳液在4 ℃下放置6個月，觀察乳液形態。將新制備、離心后得到的上層乳液和儲存6個月后的Pickering乳液分散在去離子水中，取少量滴在載玻片上，使用光學顯微鏡觀察Pickering乳液的形貌，并使用Nano-measurer軟件統計其粒徑。

1.5.2 流變性能

使用模塊化智能型旋轉流變儀測定Pickering乳液的流變性能。測試時采用平行板流變模式(plate-plate mode, PP25)，并在1 Hz恒定頻率下進行應變掃描，測定Pickering乳液的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。測試溫度為25 ℃。

1.6 二氫楊梅素的釋放動力學研究

將5.0 mL新制備的Pickering乳液裝入截留分子質量為3 000 Da的透析袋中，并將其放入50 mL離心管中，以30.0 mL體積分數95%的乙醇溶液作為透析外液。將樣品放置在25 ℃，70 r/min的臺式恒溫振蕩器中，按一定時間間隔取出3.0 mL透析外液，同時向離心管中補充3.0 mL體積分數95%的乙醇溶液以維持透析外液體積恒定。將取出的透析外液按比例稀釋后，于294 nm處測定其吸光度。將二氫楊梅素溶解于95%體積分數的乙醇-水溶液中得到不同濃度的二氫楊梅素溶液，然后使用紫外-可見分光光度計在294 nm處測定其吸光度，獲得二氫楊梅素濃度與其吸光度值的標準曲線，y=0.017 7x+0.000 03 (R2=0.999 9)，其中y為二氫楊梅素的質量濃度(mg/mL)，x為吸光度。根據上述標準曲線計算得到透析外液中二氫楊梅素的濃度。二氫楊梅素的累計釋放量(cumulative release)可由公式(2)計算得到，重復測量5次，取其平均值作為最終結果。

(2)

式中：ρn,第n次取出的透析外液中二氫楊梅素的質量濃度，mg/mL；m,Pickering乳液中二氫楊梅素的質量，mg。

2 結果與討論

2.1 CNC和DCNC的制備及表征

纖維素經酸水解，其分子間的氫鍵和無定型區域被破壞，結晶區得以保留，從而制備得到CNC。然后利用高碘酸鈉特異性地將CNC分子中鄰位羥基之間的C—C鍵斷開，造成吡喃葡萄糖單元開環，進而生成含有2個醛基的開環產物，即DCNC[21]。由圖1-a和圖1-b可知，CNC大部分處于納米級，少量的晶體相互纏結形成微米級別的纖維聚集體。氧化后得到的DCNC的微觀形貌由針狀變為棒狀。具有棒狀結構的納米粒子更有利于穩定油水界面，進而獲得更加穩定的Pickering乳液[22]。經硫酸水解制備的CNC的平均粒徑為(263.33±20.41)nm，此外隨著高碘酸鈉添加量的增加，制備的DCNC的粒徑逐漸減小(圖1-c)。高碘酸鈉在氧化纖維素分子鄰近羥基的同時，破壞部分β-1,4糖苷鍵，引起纖維素分子主鏈斷裂以造成其粒徑減小[10]。

DCNC1、DCNC2、DCNC3和DCNC4的醛基含量分別為(0.98±0.20)、(2.22±0.35)、(3.80±0.17)和(6.10±0.34)mmol/g(圖1-d)。結果表明，通過調控高碘酸鈉的用量，可以成功地制得不同醛基含量的DCNC。酸水解和高碘酸鈉氧化都會改變纖維素顆粒表面的電荷性質[23]。圖1-e為CNC和DCNC在pH 7下的Zeta電位。硫酸水解纖維素制備CNC的過程中引入了帶負電荷的磺酸酯基(OSO3-)，此外CNC和DCNC分子中含有大量的羥基[23-24]，因此，CNC和DCNC均帶負電荷。隨著高碘酸鈉添加量的增加，制備的DCNC的Zeta電位的絕對值逐漸減小，表明其穩定性逐漸降低。KALASHNIKOVA等[24]發現，通過鹽酸剝離CNC表面的電荷制備的低電荷密度的CNC能夠更好地穩定在乳液的油水界面，促進乳液良好穩定。本研究通過高碘酸鈉的氧化作用降低了DCNC的表面電荷，這將有利于DCNC在油水界面更好的自我絮集，提高Pickering乳液的穩定性。

a-AFM圖；b-TEM圖；c-平均粒徑；d-醛基含量；e-ζ-電位圖1 CNC和DCNC的AFM圖，TEM圖，平均粒徑，醛基含量，ζ-電位Fig.1 AFM images, TEM images, average particle size, aldehyde content, Zeta potential of CNC and DCNC

2.2 Pickering乳液的制備工藝研究

本研究通過超聲處理迫使溶液中的乳化劑均勻分散，而后使其能快速均勻地鋪滿液滴表面，加快其吸附過程，從而提高乳液的穩定性。從圖2可知，乳液b和e的粒徑最大，約為30 μm；乳液a、c、d、f的粒徑較小，約為3 μm。所有乳液離心前后以及儲存6個月后的粒徑基本沒有發生變化。然而在室溫下儲存6個月后，乳液b、c、e、f有油相從乳液中析出，乳液a和d表面無油相析出。乳液a和d均是通過均質和超聲相結合的工藝制備得到。該工藝下，首先通過均質獲得粗乳液，而后通過超聲進一步促進納米粒子穩定存在于油水界面，形成粒徑小且穩定性高的Pickering乳液。綜合考察乳液的穩定性、粒徑尺寸及分布，最終選用乳液a的制備工藝制備Pickering乳液。

2.3 顆粒濃度對Pickering乳液的影響

從圖3-a可知，除0.5 CNC-0.4 P和0.5 DCNC1-0.4 P外，白色乳液均能夠在倒立時承受自身質量而不流動，表明其形成了凝膠狀Pickering乳液。在制備0.5 CNC-0.4 P和0.5 DCNC1-0.4 P時，由于CNC和DCNC1所帶電荷多且濃度低，因此不能得到凝膠狀Pickering乳液。然而醛基含量較高的DCNC2、DCNC3和DCNC4在質量濃度5 g/L下均能夠穩定Pickering乳液。在相同油/水相比情況下，水相中顆粒濃度增加促使更多的顆粒在乳液界面相互堆疊，同時在乳液液滴之間的水相中也存在更多顆粒來維持乳液凝膠態的穩定性。由圖3-b可知，離心后的乳液體積隨著顆粒濃度的增加而逐漸增加。乳液的平均粒徑隨著顆粒濃度的增加而顯著減小，經10和15 g/L顆粒濃度穩定的乳液的平均粒徑無顯著性差異(圖3-c，附圖1～2，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029698)。隨著顆粒濃度的增加，納米顆粒可以更充分地對油相進行包裹，形成比表面積更大的小尺寸的乳液液滴。此外，離心前后乳液液滴的平均粒徑幾乎沒有發生變化，表明其具有良好的離心穩定性。因此，本研究選用1%顆粒濃度的CNC和DCNC制備Pickering乳液。

圖2 不同工藝條件下制備的CNC穩定的Pickering乳液(A)及其離心后的表觀圖(B)，i)新制備，ii)離心后，iii)儲存6個月后的Pickering乳液的光學顯微鏡圖(C)及平均粒徑(D)Fig.2 Images of CNC-stabilized Pickering emulsion:(A) new prepared and (B) after centrifugation.(C) Optical microscopy images and (D) average particle size of new prepared Pickering emulsion (i), Pickering emulsion after centrifugation (ii) and Pickering emulsion after six months’ storage (iii)注：a、b、c、d、e、f同1.4.1乳液a、乳液b、乳液c、乳液d、乳液e和乳液f

圖3 使用質量濃度為5、10和15 g/L的CNC和DCNC制備的Pickering乳液的形貌圖(新制備乳液，乳液倒置和離心后的形貌)(a)，Pickering乳液經離心處理后乳液層的體積(b)，離心前后Pickering乳液的粒徑(c)Fig.3 Images of Pickering emulsion prepared using 5, 10 and 15 g/L of CNC and DCNC (new and inverted state of Pickering emulsion, as well as the state of Pickering emulsion after centrifugation) (a), emulsion volume of Pickering emulsion after centrifugation (b), average particle size of Pickering emulsion before and after centrifugation (c)

2.4 油水相體積比對Pickering乳液的影響

對比圖4-a和圖4-b可以看出，低油水比下，乳液1CNC-0.2P和1DCNC1-0.2P具有流動性，而在較高油水相比下制備的Pickering乳液具有凝膠態。將乳液離心后，上層乳液的體積逐漸增大，且未出現破乳和發生油相析出的現象。此外，從附圖3、4(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029698)和圖4-c可以發現，乳液液滴的平均粒徑隨著油水相比的增加而逐漸增加。隨著油/水相比的增加，水相中的顆粒需要參與穩定更多的油相，因此形成的乳液尺寸增大。乳液在離心前后，其液滴的平均粒徑略微減小，表明其具有良好的離心穩定性。然而，當油/水相比為0.8∶1時，制備的乳液的粒徑分布不均一，且乳液發生明顯團聚。因此，以CNC和DCNC為穩定劑，采用超聲-均質相結合的方法制備Pickering乳液的最佳工藝參數如下：NaCl的濃度為50 mmol/L、CNC和DCNC的顆粒質量濃度為10 g/L、油水相比為0.4∶1。

2.5 Pickering乳液的流變性能研究

由圖5可知，Pickering乳液的儲能模量隨著DCNC醛基含量的增加而顯著增加，表明Pickering乳液的固態穩定性增強。這可能是由于DCNC的醛基含量越高，其所帶的負電荷越少，導致顆粒之間排斥力降低，相互聚集性增強，從而提高了乳液的穩定性。然而，1DCNC3-0.4P的儲能模量顯著高于1DCNC4-0.4P的儲能模量。這主要是因為高碘酸鈉的氧化造成DCNC4的粒徑顯著減小，導致顆粒間的相互堆疊面積減少，乳液界面處的界面層偏向與單層穩定。此外，分散在水相的納米顆粒因為尺寸的下降，不能很好地構建骨架來穩定整體乳液，降低了DCNC4穩定乳液液滴的能力，導致其儲能模量降低。在較低的應變下，乳液的儲能模量大于損耗模量，表示此時乳液呈現彈性或類似固體的行為。隨著應變增大到一定值，儲能模量突然下降，損耗模量突然增大。通過相交點后，損耗模量大于儲能模量，這表明此時的Pickering乳液的固體結構已被破壞，乳液內部發生重排[25]。結果表明，DCNC3穩定的Pickering乳液具有較高的穩定性。

圖4 (a)不同油水相比下10 g/L CNC和DCNC制備的Pickering乳液的形貌圖(新制備乳液，乳液倒置和離心后的形貌)，(b)Pickering乳液經離心處理后乳液層的體積，(c)離心前后Pickering乳液的粒徑Fig.4 (a) Images of pickering emulsion prepared using different oil/water ratios as well as 10 g/L of CNC and DCNC (new and inverted state of pickering emulsion, as well as the state of pickering emulsion after centrifugation), (b) Emulsion volume of pickering emulsion after centrifugation, (c) average particle size of pickering emulsion before and after centrifugation

圖5 使用油水相比為0.4∶1，10 g/L CNC和DCNC制備的Pickering乳液的儲能模量(G′)和損失模量(G″)的應變依賴性Fig.5 Strain dependences of storage moduli (G′) and loss moduli (G″) of Pickering emulsions prepared by 0.4∶1 of oil/water ratio and 10 g/L of CNC and DCNC

2.6 Pickering乳液對二氫楊梅素的釋放動力學研究

以95%乙醇-水溶液為油脂模擬物測定二氫楊梅素的釋放動力學曲線，結果如圖6所示。所有乳液均表現出先快速釋放后緩慢釋放二氫楊梅的兩級釋放過程。經CNC穩定的Pickering乳液在7 h內的累計釋放量為67.8%，顯著高于DCNC穩定的Pickering乳液的累計釋放量。此外，DCNC穩定的Pickering乳液的累計釋放量隨著DCNC醛基含量的增加而逐漸降低，1DCNC3-0.4P在7 h內的累計釋放量最少，為45.2%。這主要是由于1DCNC3-0.4P具有較高的穩定性，具有較緊湊嚴密的乳液殼層結構，有效地減緩了二氫楊梅素的釋放速率。對釋放動力學曲線進行擬合，發現CNC和DCNC穩定的Pickering乳液對二氫楊梅素的釋放動力學符合Weibull分布模型(附表1，https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029698)。結果表明，CNC和DCNC穩定的Pickering乳液具有一定的緩釋能力，其主要是基于溶出和擴散的機制釋放二氫楊梅素[26]。通過控制高碘酸鈉對CNC的氧化程度，可以有效調節Pickering乳液的穩定性和其對活性物質的緩釋速率。

圖6 使用油水相比為0.4∶1，10 g/L CNC和DCNC制備的Pickering乳液釋放二氫楊梅素的動力學曲線Fig.6 Cumulative dihydromyricetin release kinetics curves of Pickering emulsions prepared by 0.4∶1 of oil/water ratio and 10 g/L of CNC and DCNC

3 結論

通過酸水解纖維素制備得到了CNC，隨后通過調節高碘酸鈉添加量制備得到醛基含量可控的DCNC。以CNC和DCNC為穩定劑，采用超聲-均質相結合的方法制備Pickering乳液的最優工藝參數為：NaCl的濃度為50 mmol/L、CNC和DCNC懸液的質量濃度為10 g/L、油水相比為0.4∶1。在最優工藝下制備的Pickering乳液表現出良好的穩定性，乳液液滴粒徑約為2～3 μm。經CNC和DCNC穩定的Pickering乳液主要基于溶出和擴散機制緩釋二氫楊梅素，其中DCNC3穩定的Pickering乳液具有較慢的二氫楊梅素釋放速率。綜上，以DCNC穩定的Pickering乳液在食品工業及藥物載體領域具有良好的應用前景。