灰樹花多糖的分離純化、結構表征及精氨酸酶抑制活性

李彥穎，張冰茹，林庚蘭，張安強*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室，浙江 杭州，310014)

灰樹花[Grifolafrondosa(Dicks.) Gray]又名云蕈、蓮花菌等，在日本被稱為“舞茸”，是一種珍貴的藥食兩用真菌[1-2]?；覙浠ň哂胸S富的營養價值以及良好的風味，不僅可以直接烹飪食用，還可以加工成食品添加劑以及保健食品，因此數百年來在日本、中國以及其他一些亞洲地區都頗受歡迎[3-4]。

在灰樹花的子實體和菌絲體中發現多種生物活性成分，包括多糖、蛋白質、多酚、有機酸、氨基酸類、甾醇等[5-6]。20世紀80年代，從灰樹花子實體中提取出一種以β-1，6-連接的葡聚糖主鏈，并帶有1，3-連接分支的多糖，發現該多糖具有高效的抗癌活性[7]，此后對灰樹花活性成分的研究主要集中于多糖上。灰樹花多糖還具有顯著的免疫調節、降低血糖血脂、抗氧化、抗病毒和保護肝臟等功效[8]。現階段研究主要以免疫學和細胞學的角度探究灰樹花多糖抗腫瘤等生物活性，而對酶機理的研究較少。

精氨酸酶是一種雙核含錳金屬酶，可催化L-精氨酸水解生成L-鳥氨酸和尿素[9]。在哺乳動物中，精氨酸酶活性的增加與心血管系統、腎臟、中樞神經系統以及免疫系統功能障礙和癌癥有著密切聯系[10]。精氨酸酶活性過高會減少NO合酶產生NO所需的L-精氨酸供應[11]，研究發現精氨酸酶抑制劑 nor-NOHA對肝癌細胞的增殖有抑制作用，并誘導肝癌細胞凋亡，這可能與高濃度NO的促凋亡作用有關[12]。抑制精氨酸酶還可改善肥胖誘導的脂肪組織炎癥[13]。因此精氨酸酶可作為一種新型的治療靶點。目前精氨酸酶抑制劑的開發主要集中于化學合成藥物上，如2(S)-氨基-6-硼己酸、(S)-(2-硼乙基)-L-半胱氨酸和Nω-羥基-nor-L-精氨酸等，存在一定的副作用，而從植物中提取的天然類精氨酸酶抑制劑，因其安全性及有效性表現出潛在的價值。BUJOR等[14]首次證明了山茱萸、花楸和莢蒾多酚提取物的精氨酸酶抑制作用與NO依賴性血管舒張作用有關；另外，植物中的糖苷化合物也表現出精氨酸酶抑制活性[15]?；覙浠ǘ嗵菍彼崦敢种谱饔蒙袩o研究報道，故結合灰樹花多糖藥理功效良好、無毒副作用等特點，探究其對精氨酸酶的抑制活性，并進行初步的結構表征，為尋找天然精氨酸酶抑制劑和開發灰樹花多糖新型藥物提供方向和參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

灰樹花(Grifolafrondose)子實體，浙江省農業科學院；單糖標準品(D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-核糖、L-阿拉伯糖、D-巖藻糖、D-木糖、N-乙?；?D-葡萄糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺)、牛肝精氨酸酶，上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、α-異亞硝基苯丙酮、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)，阿拉丁化學試劑(上海)有限公司；MnCl2，麥克林生物科技有限公司；生物防腐劑Proclin 300、剛果紅，美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器與設備

DJ-04中藥粉碎機，上海淀久儀器公司；R-1001VN旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；QT-80FC-LCD智能自動部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器有限公司；DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光散射儀、RID-10A示差折光檢測器，美國懷亞特技術公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀、UltiMate 3000高效液相液質色譜儀，賽默飛世爾科技公司；TU-1900紫外分光光度計，北京普析通用儀器公司；SU8010場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；XE-70原子力顯微鏡，韓國帕克股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰樹花多糖的提取、分離純化

稱取200 g灰樹花子實體，粉碎后過80目篩，加入4倍體積95%(體積分數)乙醇，浸泡12 h，除去脂肪和色素。過濾后收集殘渣，自然晾干備用。

稱取20 g灰樹花子實體水浸提后殘渣，加入5.2%(質量分數)NaOH溶液，料液比為1∶20(g∶mL)，混合均勻后在57 ℃的水浴鍋中浸提2.25 h，間斷性攪拌，10 000 r/min離心10 min，過濾收集殘渣和上清液，重復提取2次。收集所有上清液，3 mol/L乙酸中和，繼續離心收集上清液。在45 ℃下減壓濃縮，透析，除去中和堿液產生的鹽，最后加入4倍體積95%乙醇，靜置24 h，離心收集沉淀，得到灰樹花堿提水溶性粗多糖。經DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析，分別用經0.45 μm 水系濾膜過濾后的0.1、0.2、0.4 mol/L NaCl 溶液洗脫，苯酚-硫酸法測定含糖量，繪制洗脫曲線。收集不同組分，濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥。根據前期實驗結果篩選出0.2 mol/L NaCl 溶液的洗脫組分再進行Sephacryl S-500 High Resolution 凝膠柱層析，經0.45 μm水系濾膜過濾后的蒸餾水洗脫，收集單一組分，凍干得到水溶性多糖GFPN-2-A組分。

1.2.2 灰樹花多糖的結構表征

1.2.2.1 分子質量及純度鑒定

采用高效尺寸排阻色譜-多角度激光散射儀-示差折光檢測(high-performance size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index，HPSEC-MALLS-RI)測定多糖的重均分子質量。準確稱取多糖樣品5 mg，用1 mL的0.1 mol/L NaNO3溶液(含有體積分數0.02% Proclin 300試劑)充分溶解，過2次0.22 μm水系濾膜，注射器吸取并手動進樣。儀器檢測條件為：激光光散射儀DAWN HELEOS II，示差折光檢測器RID-10A，系統DAWN HELEOS SYSTEM，進樣器High-Pressure Injection System，色譜柱TSKgel G3000PWXL，流動相0.1 mol/L NaNO3溶液和0.02% Proclin 300試劑，流速0.5 mL/min，進樣量100 μL，示差折光檢測器溫度為35 ℃。

1.2.2.2 紫外全掃描

配制1.0 mg/mL 的多糖溶液，在200～400 nm進行紫外光譜掃描，檢測多糖中是否存在核酸和蛋白質。

1.2.2.3 單糖組成分析

精確稱取多糖2 mg，加入5.0 mL 2 mol/L TFA，110 ℃下酸解8 h，水解后的多糖樣品和單糖標準品混合物在堿性條件下，加入500 μL的0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)-甲醇進行衍生化處理，再加入1.0 mL氯仿反復萃取至無色，3 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm濾膜，進行HPLC分析。檢測條件：色譜柱Xtimate C18(4.6 mm × 200 mm × 5 μm)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，進樣量20 μL，流動相：0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 6.7)和乙腈，體積比為83∶17。

1.2.2.4 紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)掃描

取適量的多糖樣品與KBr粉末(100～200 mg)混合，研磨均勻，壓片后在4 000～500 cm-1范圍內測定紅外光譜。

1.2.2.5 剛果紅實驗

配制2 mg/mL的多糖溶液和80 μmol/L的剛果紅溶液，各取15 mL混合，取適量混合溶液加入1 mol/L的NaOH溶液，并使得混合液中NaOH的最終濃度達到 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L，反應10 min后，在400～600 nm進行紫外掃描，記錄每個混合液的最大吸收波長[16]。以各樣品的最終NaOH濃度為橫坐標，最大吸收波長為縱坐標，繪圖。

1.2.2.6 掃描電子顯微鏡分析

取適量干燥的GFPN-2-A粉末，粘在樣品板上，放入真空噴鍍儀中噴金，加速電壓為7 kV。在高真空條件下通過掃描電子顯微鏡系統進行掃描，記錄不同放大倍數下樣品的形態。

1.2.2.7 原子力顯微鏡分析

用超純水配制0.1 mg/mL的GFPN-2-A多糖溶液，攪拌24 h以上，使多糖充分溶解，再稀釋10倍，攪拌均勻后吸取50 μL，均勻地滴在干凈的云母片上，水分自然揮干后用原子力顯微鏡在非接觸模式下觀察。

1.2.3 精氨酸酶抑制活性測定

1.2.3.1 多糖組分對精氨酸酶活性的抑制率

參考BORDAGE等[17]的方法并稍作改進，按照以下順序添加溶液(共350 μL)：(1)50 μL 0.1%(體積分數，下同)BSA緩沖液(含或不含200 U/mL的精氨酸酶)；(2)150 μL含有10 mmol/L MnCl2的Tris/HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)；(3)50 μL含有灰樹花多糖的溶液或其溶劑作為對照；(4)100 μLL-精氨酸(pH 9.7，0.1 mmol/L)。將上述混合溶液放入37 ℃水浴中反應40 min，后置于冰上，迅速加入600 μLV(H2SO4)∶V(H3PO4)∶V(H2O)=1∶3∶7終止反應。添加50 μL α-異亞硝基苯丙酮(5%乙醇配制)與生成的尿素反應，100 ℃下避光反應45 min(保持黑暗直到讀數)，冷卻后離心，5 min后在550 nm下測定吸光值，重復獨立實驗3次，取平均值。多糖組分對精氨酸酶活性抑制率按公式(1)計算：

(1)

式中：Aa，不含多糖的精氨酸酶活性的吸光值；Ac1，0.1% BSA緩沖液代替精氨酸酶的對照1吸光值；Ab，含灰樹花多糖和酶反應的吸光值；Ac2，含灰樹花多糖和不含酶反應的對照2吸光值。

1.2.3.2 多糖濃度對精氨酸酶抑制率的影響

分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL的GFPN-2-A多糖溶液，按1.2.3.1中步驟進行實驗，計算各個質量濃度下多糖對精氨酸酶活性的抑制率，每個濃度重復3次，取平均值，繪制多糖濃度-抑制率關系圖，并進行回歸分析，得到抑制率為50%時多糖的質量濃度，即IC50值。

1.2.3.3 多糖對精氨酸酶抑制類型判斷

在不同的多糖質量濃度(0.4、0.6、0.8 mg/mL)下，改變精氨酸酶濃度(50、100、150、200 U/mL)，按1.2.3.1中步驟進行實驗，測定多糖對酶活力的影響，以酶濃度為橫坐標，酶反應速率為縱坐標，繪制不同多糖濃度下的酶濃度-反應速率關系圖，確定GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制類型。

1.2.3.4 多糖對精氨酸酶抑制動力學研究

在不同的多糖質量濃度(0.4、0.6、0.8 mg/mL)下，改變底物精氨酸質量濃度(0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL)，按1.2.3.1中步驟進行實驗，計算出酶反應速率，以底物質量濃度的倒數為橫坐標，以酶反應速率的倒數為縱坐標，繪制雙倒數圖，確定抑制類型，并求得抑制動力學常數Ki。

2 結果與分析

2.1 GFPN-2-A的提取、分離純化

堿提法從灰樹花子實體中獲取水溶性粗多糖，通過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱，在不同鹽濃度的洗脫下，測定每管洗脫液的多糖含量，得到洗脫曲線如圖1-a，分別收集0.1、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的多糖樣品，命名為GFPN-1、GFPN-2、GFPN-4，收率分別為22.3%、5.4%和1.3%。根據前期活性實驗篩選結果，發現GFPN-2具有較好的精氨酸酶抑制活性，綜合考慮選取該組分進行后續分析。GFPN-2經Sephacryl S-500凝膠洗脫結果如圖1-b，在第56～70管，有一個狹窄單一的峰，說明純化效果好。將第60、61管合并收集，冷凍干燥后得到多糖組分，命名為GFPN-2-A。

a-DEAE離子交換洗脫曲線；b-Sephacryl S-500凝膠洗脫曲線圖1 GFPN-2-A的DEAE離子交換洗脫曲線和Sephacryl S-500凝膠洗脫曲線Fig.1 DEAE ion exchange elution curve and Sephacryl S-500 gel elution curve of GFPN-2-A

2.2 GFPN-2-A的結構表征

2.2.1 分子質量及純度鑒定

多糖純度指多糖分子質量在某一定范圍內，相似鏈長的平均分布。由圖2可知，經HPSEC-MALLS- RI檢測， GFPN-2-A的出峰時間在19～25 min， 并為一個單一且狹窄的峰，由此判定GFPN-2-A的分子質量分布比較均一，純度相對較高，根據線性回歸方程計算得到其分子質量為4.56 × 106Da。

圖2 GFPN-2-A的 HPSEC-MALLS-RI圖譜Fig.2 HPSEC-MALLS-RI profile of GFPN-2-A

2.2.2 紫外全掃描

GFPN-2-A的紫外全掃描光譜如圖3所示，在206 nm處有一個明顯的多糖吸收峰，而在260 nm和280 nm處無明顯的吸收峰，說明GFPN-2-A中不含游離的核酸或蛋白質類物質[18]。

圖3 GFPN-2-A的紫外全掃描光譜圖Fig.3 UV scanning spectra of GFPN-2-A

2.2.3 單糖組成

單糖混合標準品和經水解、衍生處理后的GFPN-2-A的HPLC譜圖如圖4所示，對比單糖混合標準品的乙?；Y果可知，GFPN-2-A主要由葡萄糖組成，還含有少量的葡萄糖醛酸、甘露糖、核糖和半乳糖，其物質的量比為54.00∶1.00∶0.51∶0.37∶0.68。

1-D-甘露糖；2-D-核糖；3-L-鼠李糖；4-D-葡萄糖醛酸；5-D-半乳糖醛酸；6-N-乙酰-氨基葡萄糖；7-D-葡萄糖；8-N-乙酰-氨基半乳糖；9-D-半乳糖；10-L-木糖；11-L-阿拉伯糖；12-L-巖藻糖a-單糖混合標準品；b-GFPN-2-A圖4 單糖混合標準品和GFPN-2-A的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of monosaccharide mixed standard and GFPN-2-A

2.2.4 FT-IR分析

GFPN-2-A的紅外光譜如圖5所示。

圖5 GFPN-2-A的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of GFPN-2-A

在3 382.53 cm-1處出現的強吸收峰代表—OH基團的伸縮振動，2 919.70 cm-1處的吸收峰是由于C—H的伸縮振動的結果，在1 639.20、1 421.28 cm-1處出現的吸收峰分別是羧酸根基團的對稱和不對稱的伸縮振動，表明GFPN-2-A中存在糖醛酸，與單糖組成的分析結果一致[19]。在1 730.00 cm-1附近沒有明顯的吸收峰出現，表明GFPN-2-A中的糖醛酸沒有被酯化[20]。在1 000.00～1 200.00 cm-1的吸收峰是由于C—O—C和C—O—H的拉伸振動，在896.74 cm-1處的吸收峰表明GFPN-2-A是β構型多糖[21-22]。

2.2.5 剛果紅實驗

剛果紅是一種酸性染料，分子式為C32H22N6Na2O6S2。當具有三股螺旋鏈構象的多糖分子與剛果紅形成絡合物時，在一定濃度范圍內的NaOH溶液中，其紫外最大吸收波長與剛果紅相比會向長波方向移動，尤其當NaOH濃度>0.3 mol/L后，該絡合物的最大吸收波長會發生明顯的下降[23]。由圖6可知，GFPN-2-A和剛果紅的絡合物的最大吸收波長隨著NaOH濃度的增加，逐漸向長波方向移動，說明已經形成了絡合物，而當NaOH濃度>0.3 mol/L后，相比于剛果紅溶液，最大吸收波長無明顯下降，故GFPN-2-A不具有三螺旋構象。三螺旋結構與多糖生物活性密切相關，而單糖種類較多的多糖不容易形成三螺旋結構[24]，結合單糖組成結果，GFPN-2-A是由5種單糖組成的均一多糖，因此對其三螺旋結構的形成有一定影響。

圖6 GFPN-2-A和剛果紅絡合物在不同 NaOH濃度下的最大吸收波長變化Fig.6 Change curves of maximum absorption wavelength of complexes formed by GFPN-2-A and Congo red at different concentrations of NaOH

2.2.6 掃描電鏡分析

如圖7所示，在500、1 000、5 000、10 000的放大倍數下觀察GFPN-2-A的形貌特征，發現GFPN-2-A主要以不規則的碎屑狀和片狀堆積的形式存在，在5 000和10 000的放大倍數下觀察到GFPN-2-A的表面較為光滑平整，無孔狀結構，說明分子間作用力較強，多糖分子間存在的相互排斥力較小。

a-×500；b-×1 000；c-×5 000；d-×10 000圖7 GFPN-2-A的掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of GFPN-2-A

2.2.7 原子力顯微鏡分析

原子力顯微鏡是觀察多糖大分子形態的有效工具。由圖8可知，GFPN-2-A在水溶液中的表面形貌呈現出圓柱和圓錐的塊狀特征，平均高度約為13.2 nm。WANG等[25]研究發現單個多糖鏈的高度約0.5 nm， 表明GFPN-2-A分子間的相互作用使得分子鏈發生了聚集。

圖8 GFPN-2-A的原子力顯微鏡圖Fig.8 AFM topographic image of GFPN-2-A

2.3 GFPN-2-A的精氨酸酶抑制活性測定

2.3.1 GFPN-2-A濃度與精氨酸酶抑制率

精氨酸酶催化精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素，根據尿素與α-異硝基丙苯酮反應生成粉紅色亞胺，分光光度法測定在550 nm處產生的一個最大吸光度。如圖9-a所示，GFPN-2-A的質量濃度在0～1 mg/mL時，其對精氨酸酶的抑制率逐漸增加，當質量濃度>1 mg/mL后，抑制率的增加幅度開始減小，說明GFPN-2-A并沒有使精氨酸酶失去活性，而在一定質量濃度范圍內，其對精氨酸酶的抑制率有劑量依賴性。進行回歸分析，得到GFPN-2-A對精氨酸酶的IC50值為(0.855 ± 0.64)mg/mL。

2.3.2 GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制作用分析

固定底物質量濃度不變，分別在不同的多糖質量濃度下，測定不同酶濃度的反應速率。如圖9-b，隨著多糖質量濃度的增加，酶反應速率與酶濃度的關系擬合直線的斜率逐漸降低，且每個多糖質量濃度下的擬合直線都經過原點，這說明GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制作用是可逆的，屬于可逆抑制[26]。

2.3.3 GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制動力學分析

通過酶促動力學實驗，在不同抑制劑質量濃度下，以底物質量濃度的倒數為橫坐標，酶反應速率的倒數為縱坐標，繪制線性直線，由各直線的交點所在位置即可判斷酶抑制劑的抑制類型，即雙倒數作圖法。由圖9-c可知，4組直線相交于y軸，且隨著多糖質量濃度的增加，直線與x軸的交點離原點越接近即斜率逐漸增大，說明酶促反應的Vm不隨抑制劑濃度的改變而改變，符合競爭性抑制的動力學特征，GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制作用屬于競爭性可逆抑制。以雙倒數線性直線的斜率為縱坐標，多糖質量濃度為橫坐標作圖，根據競爭性抑制的動力學方程(2)，得到的線性直線與x軸的交點，即為Ki。

(2)

根據圖9-d，求得GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制常數為0.284 mg/mL。MOTOSHIMA等[27]報道了一種茶樹菇中的巖藻半乳聚糖FG-Aa，對精氨酸酶的抑制作用也為競爭性抑制，其IC50值為(5.82 ± 0.57)μmol/L。

a-GFPN-2-A對精氨酸酶抑制率；b-GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制作用；c-GFPN-2-A抑制精氨酸酶的雙倒數；d-GFPN-2-A對精氨酸酶抑制常數圖9 GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制活性Fig.9 Inhibitory of GFPN-2-A on arginase

3 結論

采用堿提法獲取的灰樹花粗多糖，經高效分離制備得到多糖純化組分GFPN-2-A，初步結構鑒定表明GFPN-2-A是一種分子質量為4.56×106Da的酸性均一多糖，不含核酸及蛋白質，紅外分析表明其主要存在β構型糖苷鍵，單糖組成分析表明其主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、核糖和半乳糖組成，物質的量比為54∶1∶0.51∶0.37∶0.68。掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察發現GFPN-2-A表面較為光滑，無孔狀的結構，分子間作用力強，在水溶液中呈圓柱和圓錐狀的形態。剛果紅實驗表明GFPN-2-A不具備三螺旋結構。在評價GFPN-2-A對精氨酸酶的抑制作用中，其對精氨酸酶的IC50為(0.855±0.64)mg/mL，通過酶促動力學實驗，判斷抑制類型屬于競爭性可逆抑制，抑制常數為0.284 mg/mL，而GFPN-2-A與精氨酸酶活性位點的結合方式及構效關系仍有待進一步探索。

綜上，本研究發現灰樹花堿提水溶性多糖具有良好的精氨酸酶抑制活性，可作為天然的精氨酸酶抑制劑，為灰樹花多糖的新型藥物開發提供了理論基礎。