超高效液相色譜-高分辨質譜法定量測定肉類特征肽的質譜采集模式對比

王忠合，李曉婷，胡文梅，王軍*

1(韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州，521041)2(廣東省粵東藥食資源功能物質與治未病研究重點實驗室，廣東 潮州，521041)

肉類制品摻假造假現象頗為常見，在利益的驅使下，不法商販們常用較低廉的鴨肉、雞肉、豬肉等冒充牛肉、羊肉，摻入其肉類制品中，這不僅帶來極大的食品安全隱患，危害人們的宗教信仰，而且還嚴重侵害了消費者的權益和食品的公平交易[1-2]，因此，建立一種肉類及其制品的快速、精準檢測方法，用于鑒別肉類的不同種屬、及時發現摻假肉尤為重要。基于質譜的蛋白組學技術可以快速、精準的檢測目標化合物，是目前在肉類摻假鑒別中最常用的檢測方法之一。串聯質譜的多反應監測(multiple reaction monitoring/selective reaction monitoring, MRM/SRM)定量方法，一直以來就是定量的“黃金標準”，實驗的關鍵是選擇出靶蛋白的典型肽段，要求肽段含有8～25個氨基酸、相對分子質量適于四極桿掃描的質核比范圍、離子化效率高，穩定好、不易發生修飾、盡量不含有蛋氨酸(易發生氧化反應)和半胱氨酸(易發生脲甲基化和氧化反應)等殘基以減少可能的誤差[3]。同時，挑選的肽段應是唯一對應其蛋白質，以提高檢測的特異性和減少對結果的干擾，由于生物樣本的復雜性，每一個肽段往往需要選擇3個離子對(母離子-子離子)所產生的信號。

四級桿-高分辨串聯質譜技術(如四極桿飛行時間質譜儀、四極桿軌道阱質譜儀)是利用四極桿質量過濾器對母離子的高選擇性和高特異性、高分辨率的質量分析器的準確質量檢測能力，結合質量過濾器和質量分析器的優勢實現準確鑒別與高通量篩查，且該技術的發展和掃描速度的提升為目標蛋白或肽段的定量測定也提供了新的途徑。平行反應監測(parallel reaction monitoring，PRM)正是相對于傳統SRM建立起來的高分辨離子監測技術[4-5]，基于以四極桿靜電場軌道阱(quadrupole orbitrap,Q-Orbitrap)為代表的四極桿-高分辨質譜平臺，與SRM每次掃描一個離子對不同，PRM模式每次對一個母離子產生的所有離子對進行全掃描，即平行監測了一個母離子對應的所有離子對，監測精度高、無需事先確定離子對和優化碰撞能量、線性范圍廣、靶向定量靈敏度和通量更高，去除基質干擾能力強[6-7]?；诟叻直?、高精度質譜的離子監視技術，能夠對目標蛋白質、目標肽段(如發生翻譯后修飾的肽段)進行選擇性檢測，從而實現對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析和絕對定量。本文采用超高效液相色譜-高分辨質譜法對肉類特征肽的檢測方法進行探究，比較四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的PRM模式和靶標單一離子監測/數據依賴掃描(targeted single ion monitoring/data-dependent MS/MS scans，tSIM/ddMS2)采集模式定量的差異，以期優化出各肉類特征肽測定的條件，為更加快速、精準的鑒別肉類及肉類制品的蛋白來源提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質譜級乙腈、甲醇、甲酸(formic acid,FA)等，默克股份有限公司；正己烷(色譜級)、牛胰蛋白酶(Type I, 活力10 000 BAEE/mg蛋白)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT,≥99.5%)，西格瑪有限公司；硫脲(≥99%)、CaCl2·H2O(≥99%)、尿素、NH4HCO3、三羥甲基氨基甲烷(Tris≥99%)、碘代乙酰胺(iodoacetamide, IAA)等，生工生物工程(上海)股份有限公司；合成肽(SALAHAVQSSR、LADNLDTLGAAAAK、NALAHALQSAR、ALEDQLSELK、YTPVEAIEK、AAIAQAGYTDK、FISLLDELQK、TLAFLFAER)，上海強耀生物科技有限公司；固相萃取柱(HLB柱、3 mL/200 mg)，Waters公司；超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)，實驗室自制；牛肉及牛肉丸，市售。

1.2 儀器與設備

Vanquish Flex Binary超高效液相色譜、EASY-nLC 1200納升級液相色譜、Q Extractive四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀，Thermo公司；ZX4漩渦振蕩器，意大利VELP公司；ME204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Milli-Q超純水機，密理博有限公司；2-16P高速離心機，西格瑪有限公司；移液槍，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HH-30恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；As系列超聲波清洗機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白提取與酶解

分別稱取0.5 g攪碎的原料肉及肉制品置于10 mL離心管中，加入2.5 mL正己烷，超聲波處理3 min，渦旋5 min，4 500 r/min離心3 min，保留沉淀物。重復以上步驟2次，在N2的環境下使沉淀物干燥。加入4 mL提取液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl)，旋渦混勻5 min，超聲波處理3 min，4 ℃、12 000 r/min離心4 min，收集上清液，轉移到10 mL離心管中并渦旋1 min。隨后，將提取物在室溫下1 315×g離心3 min，以消除先前步驟中可能產生的泡沫[8]。該上清液即為肉蛋白原樣液，采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質的含量，4 ℃下保存。取0.1 mL肉蛋白提取液與0.9 mL水混合，渦旋30 s，取200 μL混合溶液加入裝有150 μL NH4HCO3(0.5 mol/L)的2 mL離心管中，渦旋30 s，加入10 μL DTT溶液(0.5 mol/L)，混勻后水浴處理(75 ℃，30 min)，以使溶液中的蛋白質變性，提取物冷卻至室溫。添加150 mmol/L碘代乙酰胺使蛋白質烷基化，最終濃度為15 mmol/L，暗處反應30 min。隨后，添加50 μL牛胰蛋白酶溶液(0.5 mg/L，用30 mmol/L NH4HCO3溶液配制)和10 μL CaCl2溶液(0.1 mol/L)。立即將酶解液渦旋1 min，37 ℃水浴酶解12 h。向酶解液中加入20 μL甲酸終止反應，混勻后置于室溫中15 min，加水定容至1 mL。

1.3.2 脫鹽

用HLB固相萃取柱進行脫鹽處理，先用3 mL甲醇洗滌和活化柱，然后用3 mL體積分數1% FA平衡[9]。取酶解液1 mL過柱，并用0.5 mL體積分數 1%的甲酸沖洗空的離心管，將洗滌液裝入小柱，以定量轉移樣品。然后用2 mL體積分數 1%的甲酸水洗滌小柱。最后，將肽用1 mLV(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=1∶1洗脫到10 mL的離心管中，加入洗脫液后將小柱浸泡10 min，使肽能完全洗脫。再加1 mL混合洗脫液重復洗脫1次。隨后，將全部洗脫液在N2流中吹干，色譜分析前將提取物用0.5 mL的V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=3∶97復溶，渦旋30 s，過0.22 μm有機系濾膜，上機檢測。

1.3.3 納流液相色譜-高分辨質譜法分析篩選特征肽

將肉蛋白酶解復溶液以80 MPa的壓力直接上樣到PepMap 100 C18分析柱上(75 μm×250 mm，2 μm，美國Thermo公司)，再用300 nL/min的流速進行洗脫，流動相A為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，流動相B為80%體積分數乙腈溶液(含0.1%甲酸)，梯度洗脫程序：0～2 min，2% B；2～40 min，2%～32% B；40～45 min，32%～37% B；45～50 min，37%～100% B；50～55 min，100% B。離子源為nano-Flex納噴霧離子源，正離子掃描模式，毛細管電壓2.0 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，RF-lens為50%。數據依賴性質譜(data-dependent acquisition，DDA)采集模式，一級質譜分辨率70 000@m/z200，自動增益目標值(automatic gain control，AGC)值為1e6，最大注入時間(maximum injection time，MIT)為100 ms，掃描范圍為m/z300～1 500。二級譜圖分辨率設為17 500@m/z200，最大注入時間為80 ms，掃描范圍為m/z150～2 000，隔離窗口設為2.0 Da，碎裂能量設為28，碎裂模式為HCD，AGC值為1e5，采集top N設為20，其余參數按照默認設置。

1.3.4 超高效液相色譜-高分辨質譜法測定特征肽的條件

分別取特征肽標準液或樣品溶液渦旋30 s、過0.22 μm濾膜，置于樣品瓶中，采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜進行DDA采集模式檢測。色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD C18選擇性柱(2.1 mm×100 mm，3.0 μm，Thermo公司)，柱溫40 ℃，進樣室溫度10 ℃，流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；洗針進樣，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序為：0～1 min，5% B；1～20 min，5% B～30% B；20～25 min，30% B～80% B；25～28 min，80% B；28～28.1 min，80% B～5% B；28.1～30 min，5% B。質譜條件：正離子(ESI+)模式，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb，毛細管電壓3.8 kV，離子源溫度320 ℃，S-lens RF 50%，輔助氣溫度350 ℃。一級母離子掃描范圍m/z300～2 000，二級碎片離子掃描范圍m/z50～2 000，前1 min和25 min后的流動相進廢液，離子列表為376.203 63+、576.317 62+、554.785 32+、384.547 53+、525.279 32+、672.361 92+、573.306 12+、534.297 82+、603.342 42+、563.801 82+；一級全掃描質譜采集參數：分辨率70 000@m/z200，AGC值為1e6，MIT為100 ms，分離窗口2.0m/z；tSIM/ddMS2定量采集方法：一級質譜采集參數同前，二級質譜采集參數：分辨率35 000@m/z200，AGC值為2e5，MIT為80 ms，環數為15，分離窗口2.0m/z，各肽段碎片離子和碰撞能采用優化后的值，肽段匹配優選，動態排除15.0 s，其他參數采用默認值；PRM定量采集方法：分辨率35 000@m/z200，AGC值為2e5，MIT為80 ms，環數為8，分離窗口2.0m/z，各肽段碎片離子和碰撞能采用歸一化能量(normalized collision energy, NCE)值28，預設時間(time-scheduled)窗口為2.0 min。

1.3.5 方法學驗證

本研究對超高效液相色譜-高分辨質譜法測定特征肽的線性范圍、檢出限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantification, LOQ)、基質效應、加標回收率、精密度等方法學參數進行分析。加標回收率采用在牛肉丸基質中添加低(4 μg/g)、中(20 μg/g)、高(100 μg/g)3個濃度的混合肽標準溶液，按照1.3.1和1.3.2方法酶解和過柱脫鹽后進行檢測分析，計算回收率和準確度。分別按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)為依據，計算該方法測定各種特征肽的LOD和LOQ。精密度實驗分別在不同時間重復測定100 μg/L的特征肽標準溶液的含量，以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示。移取適量的特征肽混合標準溶液，按質量比加入到按1.3.1和1.3.2處理的肉丸蛋白酶解液中，配制成一定濃度梯度的混合工作液，渦旋30 s、過0.22 μm濾膜，按照1.3.4方法測定，繪制各特征肽的標準曲線，按照公式(1)計算基質效應：

(1)

式中：KS和KM，分別為純溶劑和肉丸蛋白酶解液基質配制的特征肽工作液標準曲線的斜率。

1.4 數據檢索及處理

質譜數據采集用Xcalibur 4.2.47軟件(Thermo Scientific)，肽段DDA數據使用Proteome Discoverer 2.4(Thermo Scientific)和MaxQuant軟件進行搜庫鑒定，檢索UniProt_Bovine(包含876 759條蛋白序列)、_Chicken(包含709 277條蛋白序列)、_Pig(包含709 277條蛋白序列)、_Duck(包含842 876條蛋白序列)數據庫，一級質譜中母離子質量誤差為10×10-6，二級質譜中碎片離子質量精度：0.02 Da，酶為胰蛋白酶(trypsin)，完全酶切，漏切數目為0個，固定修飾為半胱氨酸的烷基化(C，+57.021 50 Da)，可變修飾為甲硫氨酸的氧化(M，+15.994 92 Da)，鑒定結果作為譜圖庫進行特征肽段的挑選與鑒別，通過UniProt數據庫中的BLAST算法驗證其種屬特異性。特征肽參數優化和譜圖庫離子挑選、定性確證等分析使用Skyline 20.1軟件，參數設置：截止得分0.99；添加修飾：半胱氨酸碘乙?；?carbamidomethyl)、氧化(oxidation)；配置離子對設置：母離子電荷：2+、3+、4+，子離子電荷：1+、2+，離子類型：y、b、p；串聯質譜篩選參數設置：采集方法：targeted，子離子質量分析儀：Orbitrap，分辨率：35000@200；導入fasta文件。tSIM/ddMS2和PRM數據使用Processing模板建立處理文件，導入Xcalibur采集序列表進行批處理，將處理后的序列文件用Quan Browser插件打開查看質譜圖、標準曲線等。

2 結果與分析

2.1 特征肽的篩選

納升級高效液相色譜-高分辨質譜能靈敏快速的鑒定多肽，結合數據庫搜索，短時間內可獲得大分子蛋白質的序列數據。采用高分辨率、高掃描速度的質譜對牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉等4個物種肉中的蛋白質進行了分析鑒定，極大豐富了分析結果中的蛋白質和多肽的信息，同時，也增加了質譜測定結果中的同源蛋白質和肽生物標志物的數量。圖1展示的是牛屬肌球蛋白-1來源的特征肽ALEDQLSELK(理論m/z573.306 12+)和肌紅蛋白來源的特征肽HPSDFGADAQAAMSK(理論m/z766.843 52+)的母離子色譜質譜提取峰及其二級碎片離子質譜圖，由于胰蛋白酶是在精氨酸(R)和賴氨酸(K)的羧基端將肽切斷，大部分多肽段的母離子帶有2個或3個正電荷，在低能碰撞誘導裂解產生的碎片離子主要是b-離子和y-離子，前者含有氨基末端、后者含有羧基末端，通常Q、R、K殘基會丟失氨基(-17)，S、T、E殘基等會丟失水分子(-18)，如特征肽ALEDQLSELK中y1(K-)和y6(-Q-L-S-E-L-K)分別脫氨形成m/z130.086 6和m/z700.387 0的碎片離子峰，特征肽ALEDQLSELK和HPSDFGADAQAAMSK中碎片離子y3(-E-L-K)和b8(-H-P-S-D-F-G-A-D-)失去水分子形成m/z371.228 9和m/z809.315 9的碎片離子峰。碎片離子的實測m/z與理論m/z偏差均在10×10-6范圍以內的水平，譜圖質量非常高，結果非常可信，可用于鑒別分析。

圖1 特征肽ALEDQLSELK(a)和HPSDFGADAQAAMSK(b)的二級碎片離子圖Fig.1 Fragment ion spectra of marker peptide ALEDQLSELK (a) and HPSDFGADAQAAMSK (b)

根據測定到的y系列和b系列離子的匹配情況鑒別備選特征肽段，借助UniProt數據庫的BLAST算法[10-11]可鑒定出特征肽的數量如下：雞屬19條、牛屬15條、鴨屬16條、豬屬12條，而用于定量測定分析的特征肽選擇常遵循以下原則[12]：含8～18個氨基酸、不易發生修飾而影響定量、易被質譜檢測、色譜保留性適當、碎片離子響應較強、氨基酸序列中不含C或M，從中分別選擇8條特征肽作為各種屬肉類的鑒別，具體信息如表1所示。

2.2 色譜參數的優化

肽段氨基酸序列構成會影響其溶解性、親水疏水性，從而影響其色譜保留行為和分離效果。極性較小的肽段通常需要更高比例的有機相才能洗脫出，部分性質相似的肽段需要更長時間的洗脫才能分離，但加長洗脫梯度又不可避免地會導致色譜峰變寬以及母離子信噪比降低。同時，較低的流速可以延長目標物的保留時間，但是過低的流速將引起峰展寬和拖尾，如圖2所示，親水性或疏水性較強的特征肽比較容易洗脫，且峰型較好，而特征肽1和8的拖尾現象非常明顯，這與2種特征肽的平均疏水性值(表1)接近于0的結果一致，因此應當考慮提高流速以獲得理想的梯度洗脫分離效果和良好的重現性，實驗表明0.3 mL/min的流速非常適合分離特征肽與兼容質譜分析。采用同樣的二元流動相進行梯度洗脫優化，根據前期研究[8]分別探討了梯度洗脫時間25、30、42 min等對特征肽分離效果的影響，25 min的梯度洗脫效果較差，部分特征肽不能完全分開；30 min梯度洗脫能實現特征肽較好地分離，且減少了溶劑峰的干擾；42 min梯度洗脫時特征肽的分離度最好，但分析所需時間較長，溶劑消耗量較多；30 min梯度洗脫既可降低分析所需時間和溶劑消耗量，又能夠達到快速、高效分離的要求，適合于質譜檢測，優化后的梯度洗脫條件如方法1.3.4所示。

圖2 低流速(0.2 mL/min)洗脫對色譜峰形狀的影響Fig.2 Effect of low flow rate (0.2 mL/min) elution on shape of chromatographic peaks

2.3 質譜參數的優化

碰撞能量是影響質譜信號和測定結果的重要因素，過低的碰撞能量，母離子被轟擊打碎的分子碎片較少，不利于目標物的鑒別；而過高的碰撞能量母離子被過度打碎，分子碎片增多且碎片離子較小，也不利于鑒別和定量。此外，較高碰撞能下二級定量碎片離子的信號強度較高，無其他碎片離子干擾、可提高定量分析的準確度。將選擇的特征肽段導入Skyline 20.1軟件，利用該軟件也可自動優化出四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜平臺上系列離子對、碰撞能量等參數以建立定量方法，軟件優化的碰撞能如表2所示。為簡化實驗程序可直接采用Skyline軟件優化的碰撞能進行測定，tSIM質譜采集模式測定結果也表明，用自動優化的碰撞能(collision energy, CE)值所測得的母離子和碎片離子的信號強度無顯著差異(P>0.05)。同時，采用該高分辨質譜法可解決傳統三重四極桿質譜儀中需要優化母離子與子離子對進行定量的問題，高分辨質譜儀可記錄目標母離子的全部碎片離子圖譜，且全是高分辨、高質量精度的子離子，這為準確鑒別干擾離子排除假陽性提供了非常好的幫助。PRM模式中無需優化碰撞能量，肽段測定中常用NCE值為28，其中NCE是一個無量綱數值，大致相當于質量數為500、電荷數為1的參比離子的碰撞能(單位eV)，實際使用的能量是根據所選母離子的質量和電荷數實時自動計算的，這進一步簡化了方法開發所需的時間。PRM模式中目標肽段預設時間窗口大小也是影響檢測的主要參數，預設時間窗口大小直接受目標肽段保留時間偏移的影響，窗口設定太小，目標物保留時間出現偏移檢測不出；窗口設定太大，則肽段檢測比例及掃描點數明顯減少[12]。較短的色譜梯度下肽段保留時間的偏移相對更低，且色譜表現更穩定，優化后的參數見實驗方法部分。2種采集模式下，8條特征肽段的色譜-質譜圖如圖3所示，色譜峰形尖銳，分離效果好，可用于定量分析特征肽的含量。

a-tSIM/ddMS2;b-PRM圖3 不同質譜采集模式下特征肽段的色譜-質譜圖Fig.3 Chromatography-mass spectrometry of marker peptides in different acquisition modes

2.4 方法學考察

將配制好的合成肽混合標準系列樣品液按1.3的色譜-質譜條件進行超高效液相色譜-高分辨質譜測定，記錄各特征肽出峰時間和母離子及碎片離子的峰面積，以各特征肽的峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，結果如表2所示。結果表明，8條特征肽在2種質譜采集模式(tSIM/ddMS2和PRM)下具有良好的線性關系，線性相關系數均>0.99，2種質譜采集模式下的相關性差異不大(P>0.05)，2種采集模式下的檢出限分別為0.04～0.19 μg/L、0.01～0.16 μg/L，PRM模式采用二級碎片離子加和方式表示出峰情況，其檢測限更低。

由表3可知，牛肉丸樣品提取液不影響特征肽pep2、pep5、pep6、pep7、pep8的測定，即不存在基質效應，而對特征肽pep1、pep3、pep4產生一定的抑制效應。各特征肽的加標回收率高，該回收率與多肽平均疏水性的相關系數為0.982，這主要是由于HLB為反相親水性的改性苯乙烯聚合物，對蛋白質、多肽、氨基酸等具有較好的保留，表1中多肽平均疏水值<0表示多肽為疏水性，疏水值>0表示多肽為親水性，pep5和pep6的疏水性較強，其保留效果較差、回收率偏低，應用中可根據多肽的平均疏水性值選擇合適的固相萃取柱和洗脫溶液。

2.5 樣品測定

為了驗證所建立分析方法的適用性，對市場上購買的不同價位的12種牛肉丸樣品進行檢測，結果如表4所示。本次抽樣篩查的牛肉丸樣品中共檢測出5條不同種屬的特征肽，其種屬來源分別為牛肉2條、豬肉1條、雞肉1條、牛肉和雞肉共有1條，在檢測的樣品中不含其他種屬肉類的比例為41.7%，牛肉丸樣品中標明混有其他肉類的比例為42.8%，這表明市售的牛肉丸中部分產品混有其他種類的肉，其混入量不等，且有的產品中豬肉混入的量非常高。

如圖4所示，2種質譜采集模式下均測出強信號的豬肉源特征肽。

a-PRM;b-tSIM/ddMS2圖4 兩種采集模式測定的樣品2中特征肽的色譜-質譜圖Fig.4 Chromatography-mass spectrometry of marker peptides in sample 2 determined by two acquisition modes

鴨肉中的1條特征肽(pep4)在部分樣品的色譜-質譜圖中也出峰，如圖5-a所示，但與特征肽pep4的二級質譜(圖5-b)對比可以看出碎片離子不同，出峰的應為干擾雜質，即鴨肉的2條特征肽均未測得，這表明牛肉丸樣品中未混入鴨肉。從測定結果可以看出，本方法可以利用高分辨質譜的二級圖譜有效排除假陽性結果，抽檢的樣品中S2和S7的測定結果與標識一致，這表明所建方法可靠，可用于肉及肉制品中蛋白種屬來源的鑒別和測定，比已報道[13-14]的三重四極桿質譜法的鑒定能力更強。

a-干擾物的二級質譜圖；b-特征肽pep4的二級質譜圖圖5 樣品8中干擾物與特征肽pep4的質譜圖對比Fig.5 Comparison of mass spectrograms of interfering substances in the sample 8 with pep4

基于超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的tSIM/ddMS2和PRM兩種采集模式建立的定量測定8條不同種屬來源的肉類特征肽的方法檢出限分別為9.84～33.13 μg/kg、2.46～27.90 μg/kg，遠優于采用納升級液相色譜-四極桿飛行時間質譜的數據依賴型采集模式測定5條特征肽的方法[15]，且本文建立的方法重現性和測定所需時間也優于納升級液相色譜法，這與文獻[16]報道的鑒別出的蛋白數量少而夠用的情況下采用超高效液相色譜分析以提高其重現性的結果一致。同時，基于高分辨質譜法的靈敏度遠低于三重四極桿質譜法的靈敏度[13,17]，這主要是由于三重四極桿質譜在靶向定量方面具有非常出色的檢測能力，但在鑒別復雜基質中共洗脫的質核比相近的肽段方面的分辨率較低而出現假陽性結果[18]，而采用四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的tSIM/ddMS2和PRM兩種采集模式可借助二級圖譜的精確質量數進行鑒別有效排除假陽性結果。隨著高分辨質譜技術的進步和設備升級、檢測能力增強，特別是近年來報道的四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的PRM模式在定量能力方面可以“媲美”高端三重四極桿[19]，使其在定量檢測領域得到廣泛的應用，因而本文建立的采用tSIM/ddMS2模式的一級質譜圖和PRM模式的二級質譜圖定量測定特征肽的方法可為準確快速地鑒別肉制品中蛋白質種屬來源和肉類摻假情況提供強有力的支撐。

3 結論

納升級高效液相色譜-高分辨質譜法篩選出的8條特征肽碎片離子的實測質核比與理論值偏差小，譜圖質量高，結果可信，可用于肉種屬鑒別和分析。牛肉丸樣品中蛋白質變性程度大，需用強提取緩沖液經超聲輔助法提取，胰蛋白酶酶解后經固相柱凈化去除基質中的鹽類等干擾物，超高效液相色譜梯度洗脫分離，采用四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的PRM和tSIM/ddMS2采集模式定量測定，較低的色譜流速對平均疏水性值接近0的2條特征肽洗脫難、拖尾嚴重，梯度洗脫流速增加至0.3 mL/min可有效減少峰展寬與拖尾，且采用前1 min的液相洗脫液直接進廢液的方式可有效降低鹽分對質譜儀的損害和目標肽段離子化的抑制效應。碰撞能是影響質譜測定結果的重要因素，PRM采集模式不需優化碰撞能可直接采用NCE為28的值，tSIM/ddMS2采集模式可采用Skyline軟件優化出的最優CE值，從而簡化優化CE的過程。PRM模式在測定較多目標物時需預設時間窗口，以提高目標物檢測的通量，常用時間窗口為1.5～2.0 min，以盡量避免出峰時間波動對目標物檢測的影響和窗口太大肽段檢測比例及掃描點數明顯減少的影響。不同采集模式下各特征肽標準溶液質量濃度的線性關系良好(相關系數≥0.99)，tSIM/ddMS2和PRM采集模式下的檢出限分別為0.04～0.19 μg/L、0.01～0.16 μg/L，在牛肉丸提取液中的基質效應介于81.3%～114.7%，3個添加濃度下的加標回收率在89%～117%且相對標準偏差≤10%(n=5)。2種采集模式均可利用二級碎片離子鑒別目標物以提高檢測的準確性，且PRM采集模式應用二級質譜的加和峰進行定量檢測限更低，12批次牛肉丸樣品檢測中共檢出含有豬肉源或雞肉源特征肽的比例為58.3%，其中有明確標識的為42.8%，部分產品中檢測出豬肉源特征肽的信號強度非常高。