ε-聚賴氨酸發酵工藝的研究進展

王月，扶教龍，張昳

(蘇州科技大學 化學與生命科學學院，江蘇 蘇州，215009)

同源多聚氨基酸是線性合成聚合物，由獨特類型氨基酸的重復單元組成。迄今為止，已經發現了由微生物分泌的4種同源多聚氨基酸，包括聚ε-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)、聚γ-谷氨酸、聚γ-L-二氨基丁酸和聚L-α，γ-二氨基丁酸[1-3]。其中，ε-PL是一種新型的天然同型單體聚合物，由25～35個L-賴氨酸通過α-羧基和ε -氨基形成的酰胺鍵連接而成。

由于其獨特的結構，ε -PL具有很多優異的性能，例如可生物降解、水溶性、熱穩定、抗菌、可食用和無毒等。此外，它還表現出良好的內毒素選擇性去除和抗肥胖特性，改善細胞黏附，抑制胰腺脂肪酶活性，并防止口腔細菌毒素產生[4]。因此，ε-PL具有作為抗菌食品防腐劑，治療基因或藥物載體，酶穩定劑和化妝品成分的巨大潛力。ε-PL對單增李斯特菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌等微生物表現出優異的抗菌效果且抗菌譜廣，這些優點使得ε -PL主要用作天然食品防腐劑[5]。日本在19世紀80年代首次將ε-PL批準作為食品防腐劑。后來，陸續被美國、韓國、中國等國家和地區批準使用。

目前，ε -PL主要通過白色鏈霉菌發酵生產。與化學方法相比，微生物法生產ε-PL具有條件溫和、原料來源廣、操作簡便和綠色環保等優點[6]。ε-PL是1977年在SHIMA等[1]篩選Dragendorff-Positive(DP)化合物時首次發現的，至此為了開發ε-PL進行了越來越多的研究，包括產ε-PL菌株的選育[7]、ε-PL發酵工藝開發[8]以及ε-PL生物合成機制的探究[9]等。近年來，隨著基因工程、代謝組學、蛋白質組學、生物信息學以及先進測試技術的發展，對ε-PL生物合成機理的研究越來越深入。當然，ε-PL的高效低成本生產是一個不變的主題，最近幾年研究人員開發出了一些新型高效的發酵工藝用于ε-PL生產。本文對高產ε-PL菌株的選育方法和合成機理進行了簡要概述，著重綜述了其發酵工藝優化的最新研究進展。希望幫助相關研究者和生產技術人員了解這種新型聚合物的最新進展和未來發展趨勢。

1 ε-聚賴氨酸的概述

1977年日本學者SHIMA和SAKAI從微生物中篩選DP物質時，篩選到1株穩定且能大量產生DP物質的放線菌(白色鏈霉菌Streptomycesalbulus)，通過對其產物進行酸水解并進行結構解析得知該物質為一種通過α-羥基和ε-氨基之間脫水縮合而形成的聚合物——ε-聚賴氨酸[1]。ε-PL的抑菌譜非常廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌都有較好的抑制效果。其抑菌效果主要受其表面陽離子量及聚合度影響，通過靜電吸附與目標的細胞膜相結合，進而細胞喪失正常的流動性，細胞膜破裂，胞內物質外溢，最終導致細胞自溶死亡[5]。ε-PL分子質量在 3 600～4 300 Da 具有較好的抑菌性能，當分子質量低于1 300 Da 的時候，就會失去抑菌活性。對ε-PL的水溶液進行核磁共振和圓二色譜分析后發現，不同pH條件對ε-PL在溶液中的構型有很大的影響[10]。

目前，學界認可的合成途徑為：ε-PL產生菌通過二氨基庚二酸途徑合成前體L-賴氨酸，并將其用于ε-PL的組裝，圖1為其可能的簡化生物合成途徑。隨后，研究人員嘗試探究其生物合成機理。SHIMA等[11]用14C 放射性同位素標記證明L-Lys是ε-PL的前體。然而，賴氨酸單體組裝成聚合物的機理尚不清楚。經過很長時間后，KAWAI等[12]在無細胞系統中實現了ε-PL生物合成，膜部分的合成活性主要依賴于ATP，不受核糖核酸酶、氯霉素或卡那霉素的影響。這些結果表明，膜中存在的非核糖體肽合成酶(non ribosomal peptide synthetase，NRPSs)最有可能催化ε-PL的生物合成。2008年，CHEN等[9]成功純化并表征了ε-PL合成酶(Pls)。通過對Pls結構的分析，發現Pls是具有典型A域和T域的單模塊NRPSs。其中A和T結構域負責L-賴氨酸的捕捉、活化和轉化，而傳統的C域變為C1、C2和C3結構域來負責將已活化的L-賴氨酸連接，這種新型的單模塊 NRPS 結構可能是這些均聚氨基酸合成酶的共同特征，結構域的相互連接作用對酶活性至關重要。Pls是ε-PL合成途徑中的主要限速酶之一，這些研究為進一步利用基因工程方法提高白色鏈霉菌生產ε-PL能力奠定了良好基礎。

圖1 ε-PL的合成途徑示意圖Fig.1 The synthetic route of ε-poly-L-lysine

2 產ε-PL菌株分離和改造

如引言部分所述，高產ε-PL菌株的篩選是實現ε-PL工業生產的關鍵。野生型產生菌的ε-PL產量極低[一般ρ(ε-PL)<0.2 g/L]，故借助菌株選育方法提升其合成能力是實現ε-PL工業化生產的必經之路[13]。目前，已用于高產ε-PL生產菌選育的方法有檢測堿性/酸性染料與培養基中分泌的聚陽離子ε-PL之間的相互作用。如NISHIKAWA等[14]采用Poly R-478酸性染料篩選的方法從土壤中發現了超過10種產生ε-PL的菌株。此后，根據這種方法或改進的方法篩選了其他幾種高效產ε-PL的菌株，如S.albulusNK660[15]和S.griseofuscusH1[16]。另一種常用的菌株篩選方法是“兩階段控制法”。SHIMA等[17]基于細胞生長的最適pH值與S.albulusNo.346 中 ε-PL 積累之間的差異提出了這種方法。隨后，HIROHARA等[18]開發了兩階段培養方法，其中每個菌落首先在生長培養基(pH 6.8)中培養20～48 h(細胞生長培養階段)，然后收集、洗滌、重懸菌絲體并在生產發酵液中培養(pH 4.5，ε- PL生產培養階段)。“兩階段控制法”已經被廣泛使用，許多產ε-PL菌株已成功分離和研究，例如Streptomycessp.USE-11[18]和StreptomycesahygroscopicusGIM8[19]。

為了提高ε-聚賴氨酸產生菌的合成能力，對菌株進一步改造具有重要意義。王靚[20]運用核糖體工程選育ε- PL高產菌株，并結合傳統誘變和基因組重排，構建了單抗和多抗突變株，大幅提高了ε-PL的搖瓶產量。LIU等[21]引入鏈霉素抗性，通過1 631個突變體的篩選獲得了產量最高的突變體S.albulusSS-62，其ε-PL搖瓶發酵的產量為3.04 g/L比親本菌株高1.79倍。XIANG等[22]在細胞和分子水平上研究了常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)誘變對白色鏈霉菌的影響，誘變后ε-PL產量增加了18.46%。越來越多研究表明通過引入耐藥突變可以顯著激活抗生素對鏈霉菌次級代謝產物的生產。近年來除了傳統理化誘變育種，基因組重排、核糖體工程、基因工程和高通量篩選等方法也在提高菌株的初級和次級代謝物上廣泛應用，加快了我們對ε-PL生物合成機制的深入了解和構建ε-PL高產菌株進程。

3 ε-PL生產的發酵工藝

3.1 培養基的優化

培養基成分可能會影響微生物的生長和產物代謝積累。早在2006年SHIH等[23]通過響應面法開發了一種適用于S.albulusIFO 14147的培養基。結果顯示，S.albulusIFO 14147生產的ε-PL產量增加了約9倍。同樣，BANKAR等[24]使用Placket-Burman設計方法優化的培養基成分，用于S.nourseiNRRL 5126生產，ε-PL產量從基礎培養基中的41.81 g/L提高到98.07 g/L。CHHEDA等[25]使用正交設計方法確定了新型ε-PL生產者蠟狀芽孢桿菌的最佳培養基組成，使得ε-PL產量從36.29 mg/L顯著提高至83.49 mg/L。盡管培養基優化方法可能工作量繁重，但是對于ε-PL的生產非常有效。M3G培養基是第一個被報道用于ε-PL發酵的培養基，并且仍然常用。目前基于這種原始培養基設計了各種優化培養基的方法，例如單因子法，正交陣列法[25]，響應面法[8,23-24]和人工智能神經網絡[26]。

同時，在研究ε-PL的過程中，研究人員發現某些工業副產物可以替代ε-PL生產中常用的碳源和有機氮源，這不僅可以降低ε-PL生產的成本，而且將副產物轉化為增值化合物。例如扶教龍等[27]發明了一種以木薯渣水解液為碳源生產ε-PL的方法，其特征在于以木薯渣水解液作為發酵培養基或補料培養基中的碳源。木薯渣是淀粉廠和酒精廠的下腳料，國內外每年廢棄量相當大，嚴重污染環境，這種開發利用是環保和經濟的，因為它將廢棄的原料轉化為高價值產品。另外一些研究人員嘗試利用包括甘油和甘蔗糖蜜在內的替代碳源來生產ε-PL，特別是近年來大量開發的粗甘油基化學品與新材料研究具有廣闊的發展前景[28]。甘油在ε-PL生產中應用最成功的是由REN等[19-20]進行的，他們首先優化了以甘油為碳源的ε-PL生產的培養基，基于該介質進行了一系列改進。最終，在5 L生物反應器中ε-PL的生產從最初的2.27 g/L提高到62.36 g/L。在另一項研究中，XIA等[31]嘗試使用甘蔗糖蜜水解生產ε-PL，優化初始總糖濃度后，在1 t發酵罐中獲得20.6 g/L的ε-PL。在這種情況下，制糖業的副產品可以被成功轉化為ε-PL。培養基的價格占ε-PL工業發酵中運營成本的很大一部分，因此，低成本的工農業廢物作為ε-PL發酵的替代碳源具有很大的前景。

3.2 pH控制策略

pH沖擊策略能有效提高細胞的抗氧化能力，減少細胞的氧化損傷，這可能是信號轉導系統在應對pH沖擊中所起的重要作用，并導致代謝活力和細胞內氧化還原穩態的增強[32]。生產ε-PL最經典的發酵策略是兩階段pH控制法，據此方法報道的S.albulusS410的ε-PL的生產量為48.3 g/L[33]。直到最近，在提升ε-PL產率上才取得突破，并通過pH沖擊策略超過了KAHAR的相關研究結果[29]。

在ε-PL的深層發酵中，研究人員發現如果不控制酸堿度，ε-PL發酵液的pH會自然從初始值約6.5～7.0連續降低至約3.0，同時有較低ε-PL的積累。進一步的實驗表明，積累ε-PL的最佳pH為4.0，細胞生長的最佳pH為6.0。因此，pH控制策略通過自動進料堿溶液(即NaOH或NH4OH)是確保ε-PL高生物量充分積累的有效方法。在此基礎上，KAHAR等[33]使用2個不同的pH階段將S.albulusS410生產ε-PL的整體產量從5.7 g/L提高到40.3 g/L；在第一階段中，將發酵液的pH值保持在5.0以上以促進細胞生長，而在第二階段中，ε-PL積累時的pH值則保持在4.0。REN等[29]通過將其與酸性pH沖擊相結合，改進了這種經典的pH控制策略。改良的發酵過程可分為3個階段，即在pH 5.0下的預酸沖擊適應階段，在pH 3.0時進行酸性pH沖擊以及pH恢復至4.0階段生產ε-PL。最終，發酵液中ε-PL最大產量達到54.70 g/L。與KAHAR等[33]的經典兩段pH控制策略相比，生產菌株的代謝活性在pH沖擊期受到嚴重抑制，從而導致調節基因、生物合成基因和應激反應基因的過量產生。因此，當pH值回到4.0時，細胞的生長和ε-PL的產量顯著增強。綜上所述，pH是ε-PL生物合成的關鍵參數。無論采用哪種策略，pH 4.0最適合ε-PL的形成，而較高的pH(大于4.5)對細胞生長更好。

3.3 溶解氧控制策略

發酵液中的溶解氧(dissoved oxygen,DO)水平也是ε-PL生產中的另一個關鍵參數。ε-PL的生物合成和細胞生長都需要大量的ATP，這主要是通過有氧呼吸產生。這表明發酵液中的高溶解氧水平將有利于細胞生長和ε-PL的生物合成。然而，由于高耗氧量和細胞密度，ε-PL發酵液中的氧氣供應通常受到限制。

在這方面，BANKAR等[34]通過研究不同的曝氣攪拌條件，建立了適合生產S.nourseiNRRL 5126發酵動力學的兩階段DO控制策略。在此條件下，恒定的DO水平(細胞生長期為40%，ε-PL生產階段為20%)有效地提高了ε-PL的產量和生物量，分別達到1.99 g/L和20.73 g/L。由于菌絲相互纏繞，細胞密度大和ε-PL的分子質量高，使得發酵液變得黏稠，并且氧轉移效率低。因此，僅通過改善發酵過程中的攪拌和曝氣來提高DO水平是困難的。此外，由于伴隨著高剪切應力，攪拌轉速的增加還可能導致對菌絲體形態、產物形成和ε-PL產量有不良影響。在這種情況下，XU等[35]嘗試使用2種策略來改善S.albulusPD-1的氧氣限制問題。第一種是將氧氣載體添加到發酵液中，在發酵液中添加0.5%的正十二烷可以有效地使DO含量保持大于 32%的飽和度，在氧氣升高的條件下，ε-PL產量從23.4 g/L提高至30.8 g/L。第二種是通過將透明顫菌血紅蛋白基因引入S.albulusPD-1染色體，將氧氣輸送到末端呼吸氧化酶來幫助增強呼吸和氧化磷酸化增強其結合氧的能力，使得ε-PL的產量從22.7 g/L增加到34.2 g/L。細胞內ATP含量的測定表明，在供氧充足時S.albulusPD-1中產生了更多的ATP，這可能與更強的碳和能量代謝有關[36]。

3.4 生物反應器

優化生物反應器也可以提高發酵整體工藝效率。ε-PL生產中最常用的生物反應器是具有機械攪拌和常規通氣的反應器。然而，研究人員并沒有放棄設計用于ε-PL生產的新型生物反應器。早在2002年，KAHAR等[37]就對氣升式生物反應器(airlift bioreactor，ABR)的ε-PL生產進行了評估，減少攪拌意味著細胞內核酸等物質的泄漏量減少，所以該反應器生產成本、能源消耗和下游加工成本都很低。因為ε-PL是天然陽離子聚合物，所以應用陰離子樹脂吸附累積的ε-PL，原位產物去除(insituproduct removal，ISPR)通過克服積累的ε-PL反饋抑制作用和毒性效應極大地提高了ε-PL的最終產量[38]。細胞固定化是ε-PL生產的另一新策略，ZHANG等[39]將絲瓜絡用作ε-PL生產的綠色固定材料，將ISPR與細胞固定技術相結合，最終ε-PL的產量和菌體量分別達到34.1和26.5 g/L。在這種條件下，固定化的細胞最多能使用5次，而且除第一批外幾乎沒有觀察到滯后相，這大大縮短了發酵周期。這種新型的固定裝置已經在新光生物科技公司中得到了應用。此外，目前報道的所有ε-PL生產都是通過深層發酵進行的，細胞固定化研究中使用的絲瓜絡類似于固態發酵中的固態底物[40]。這些結果表明，固態發酵有希望在不久的將來應用于生產ε-PL。

3.5 其他生產工藝

表1 微生物生產ε-PL主要方法和篩選策略比較Table 1 Comparison of main methods and screening strategies for microbial production ε-PL

續表1

4 結論與展望

鑒于ε-PL天然和高效的陽離子特性，ε-PL及其衍生物在食品、生物醫學和生物材料工業中具有獨特的應用，例如用作膳食添加劑、藥物載體、生物芯片等。為了滿足ε-PL迅速增長的需求，其商業化生產必不可少。自從篩選出第1株生產ε-PL的菌株以來，研究人員一直在尋求多種發酵策略以提高ε-PL的生產率，每種方法都有其自身的優勢，可以補充完善ε-PL的生產信息。當然，許多問題，如復雜代謝網絡的調節，ε-PL生物合成的低生產率和轉化率，阻礙了其廣泛的商業應用[49]。

對于今后的研究探索有3點展望：(1)高產菌株的選育。鏈霉菌生長周期較長，傳統的搖瓶方法篩選ε-PL正突變菌株耗時耗力，需要經過長期多輪誘變以積累穩定的優良性狀，才能獲得高產菌株。因此，可以結合高通量篩選建立一種快速、準確的選育方法。(2)生物合成機理的深入研究。闡明ε-PL生物合成及其在轉錄組學、蛋白組學和代謝組學上的抗菌活性機制，可以深層次、全方位解析某種ε-PL高產菌株高產機制及其代謝途徑，并將為進一步提高ε-PL的產量提供理論依據。(3)發酵生產工藝的優化。ε-PL工藝優化是今后的發展趨勢之一，制定合適的工業副產物綜合利用策略既降低成本又廢物利用。另一方面也可以減少發酵過程中有機試劑的加入從而獲得環境友好型產物。希望本文，可以為解決和研究與微生物ε-PL相關的目前存在的問題提供借鑒，從而實現高效率、低成本ε-PL發酵生產。