基于網絡藥理學探究黃精防治阿爾茨海默病作用機制

朱徐東，黃麗萍，朱娜，王松，姚偉，吳毅

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以記憶力減退、認知功能障礙、行為能力異常為臨床特征的神經退行性疾病。目前對阿爾茨海默病的發病機制有一些假說，包括基因突變學說（β-淀粉樣蛋白異常沉積、Tau 蛋白過度磷酸化與ApoE 基因異常表達），神經遞質學說，神經炎癥學說等［1］。中藥材中一些有效成分（如苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類等）對防治AD 有一定的療效并且毒性小［2］。

黃精，屬于百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根狀莖，是一種藥食同源性中藥，具有補氣養陰、潤肺、補脾、益腎等功效，也具有防治阿爾茨海默病、改善學習記憶能力、提高免疫力等藥理作用。黃精含有多糖、黃酮、木脂素、生物堿、皂苷等化學成分，這些成分使其具有多種藥理活性。有研究顯示黃精可通過增強α7nAChR 的表達［3］、減少海馬組織中Aβ 沉積［4］改善AD 模型大鼠的學習記憶能力。

網絡藥理學方法是基于系統生物學理論，對生物系統的網絡分析。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節，與中藥多成分、多靶點、多途徑的防治原理相符合。本文采用網絡藥理學方法探討黃精防治AD 的可能作用機制，以期能為黃精的深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 黃精化合物的獲取和篩選

通過TCMSP 數據庫（中藥系統藥理學分析http://tcmspw.com/tcmsp.php）、查閱相關文獻［5-10］以及課題組從炆黃精中分離得到的24 個化合物(純度＞90%)［11-12］獲取黃精的化學成分。為了便于分析，將黃精中的化合物命名為HJ001、HJ002 等。通過Chemdraw 軟件將收集到的化合物轉化為sdf 文件格式，導入Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平臺，對收集到的化合物進行篩選。

1.2 活性成分靶點預測

將活性成分的sdf 文件導入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺，設置屬性為“homo sapiens”，預測活性成分的潛在靶點，刪除重復值得到活性成分靶點。

1.3 AD 疾病相關基因的篩選

以“Alzheimer's disease”為關鍵詞，從Genecards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、Drugbank（http://go.drugbank.com）三個疾病靶點數據庫搜集AD 有關的基因，合并三個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到AD 相關靶點。

1.4 黃精防治AD 成分-靶點PPI 網絡構建

將篩選得到的活性成分靶點和AD 疾病靶點利用R 語言取交集并繪制韋恩圖，將交集靶點導入到STRING 數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”（人源）、最小相互作用閾值（medium confidence）設為“0.4”，得到蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。運用Cytoscape 3.7.0軟件分析PPI網絡拓撲屬性，并篩選其中的關鍵靶點。

1.5 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

將黃精防治AD 的關鍵靶點錄入Metascape 平臺（http://metascape.org/），輸入物種（Input as species）和分析物種（Analysis as species）均選擇 “H.sapiens”，P＜0.01，對黃精防治AD 關鍵靶點進行GO 注釋分析和KEGG 通路富集分析。

1.6 黃精防治AD 成分-靶點-通路網絡圖的構建

將篩選所得有效成分、關鍵靶點以及靶點所屬信號通路導入Cytoscape 3.7.0 軟件，構建黃精防治AD 成分-靶點-通路網絡。

1.7 分子對接

運用Cytoscape3.7.0 軟件對篩選的關鍵靶點與活性成分進行分子對接，同時以經FDA 認證的臨床防治AD 的藥物多奈哌齊（Donepezil）、加蘭他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、美金剛（Memantine）為陽性對照進行分子對接，在Uniprot 數據庫（http://www.uniprot.org)中搜索關鍵靶點對應的Entry，在PDB 數據庫（http://www.rcsb.org）中下載靶點的3D 結構。用Discovery Studio 2016 軟件對其進行去水、加氫、分配電荷等處理，運用LibDock 模塊與活性化合物及陽性藥進行分子對接。

2 結果

2.1 黃精活性成分

通過TCMSP 數據庫、相關文獻調研以及實驗室獲取對黃精的化學成分進行收集，共得到105 個化合物。利用Swiss ADME 平臺對所收集到的成分進行類藥性篩選后，共有54 個符合條件的化合物，見表1。

表1 黃精活性成分

2.2 靶點預測

基于Swiss Target Prediction 平臺預測活性成分的潛在靶點，共得到4 463 個基因靶點，根據Probability＞0.12 進行篩選并刪除重復值后共得到152個潛在活性成分靶點。利用OMOM、Drugbank 以及GeneCards 疾病數據庫對“Alzheimer's disease”相關基因進行檢索，合并后刪去重復值共得到1 597 個潛在疾病靶點。

2.3 黃精防治AD 成分-靶點PPI 網絡的構建

將潛在黃精活性成分靶點與AD 疾病靶點取交集，并通過R 語言繪制韋恩圖，得到黃精成分-AD 共同靶點66 個，見圖1。將共同靶點在String 數據庫中進行PPI 網絡分析，最小相互作用閾值設為“0.4”，形成376 個蛋白互作關系對，見圖2。利用Cytoscape3.7.0 對PPI 網絡進行分析，由于網絡節點“degree”中位數為9，故以“degree”大于等于2 倍中位數的值（degree ≥18）為條件進行篩選，得到14 個候選靶點；然后對其進行degree、betweenness、closeness 計算分析，再以大于等于中位數的值進行篩選（degree ≥22、betweenness ≥2.07、closeness ≥0.867），得 到5 個關鍵 的防治AD 的靶點，即SRC、PTGS2、MMP9、EGFR、STAT3，見圖3。

圖1 黃精成分-AD靶點韋恩圖

圖2 黃精成分-AD靶點PPI網絡

圖3 黃精防治AD成分的PPI網絡篩選

2.4 基因功能與通路富集分析

利用Matescape 數據平臺對66 個黃精防治AD的潛在靶點進行GO 注釋分析和KEGG 通路分析，利用GraphPad Prism 9.0.0 繪制熱圖，結果見圖4。

圖4 黃精中有效成分對AD潛在靶點的富集分析

GO 注釋分析包括生物過程（Biological Process，BP)，細胞組 成（Cellular Component，CC）和 分子功能（Molecular Function，MF）三個部分。其中生物過程排名靠前的有炎癥反應（inflammatory response）、對無機物的反應（response to inorganic substance）、活性氧 代謝過 程（reactive oxygen species metabolic process）、激酶活性的正調控（positive regulation of kinase activity）；細胞組 成中靠前的有受體復合物（receptor complex）、膜閥（membrane raft）、膜 側（side of membrane）、軸突（axon）；分子功能中靠前的有氧化酶活性（oxidoreductase activity）、蛋白質激酶活性（protein kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、電子傳輸活動（electron transfer activity）。KEGG 通路富集分析中，排名靠前的有癌癥信號通路（Pathways in cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、內分泌抵抗（Endocrine resistance）。

2.5 黃精防治AD“活性成分-靶點-通路”網絡構建

將黃精成分、作用靶點和KEGG 通路信息導入Cytoscape 3.7.0 構圖軟件，構建黃精防治AD“活性成分-靶點-通路”網絡，見圖5。該網絡中包括108 個節點，372 條邊。108 個節點中20 個節點為黃精防治AD 涉及的活性成分，66 個節點為黃精防治AD 作用靶點，20 個節點為AD 靶點參與的信號通路。該網絡說明黃精防治AD 作用可能具有多成分、多靶點、多環節作用的特點。

圖5 黃精防治AD成分-靶點-通路網絡圖

2.6 分子對接驗證結果

將PPI 網絡中篩選的5 個靶點作為黃精抗AD的關鍵靶點，與黃精抗AD 的20 個活性成分以及臨床防治AD 的藥物多奈哌齊（Donepezil）、加蘭他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、美金剛（Memantine）進行分子對接，并以對接打分值構建熱圖，見圖6。其中，陽性藥中與5 個關鍵靶點對接打分最高的是多奈哌齊，最低的是美金剛；并且20 個化合物中，與SRC（PDBID:1Y57）對接打分高于多奈哌齊的有10 個化合物，高于加蘭他敏的有19 個化合物，高于卡巴拉汀的有20 個化合物；與EGFR（PDBID：1Z9I）對接打分高于多奈哌齊的有4 個化合物，高于加蘭他敏的有17 個化合物，高于卡巴拉汀的有18 個，20 個化合物的對接打分均高于美金剛；與PTGS2（PDBID:5F19）對接打分高于多奈哌齊的有2 個化合物，高于加蘭他敏和卡巴拉汀的均有17個化合物，高于美金剛的有20 個化合物；與STAT3（PDBID6NJS）對接打分高于加蘭他敏的有14 個化合物，高于卡巴拉汀的有17 個化合物，高于美金剛的有20 個化合物；與MMP9（PDBID:6ESM）的對接打分高于多奈哌齊的有5 個化合物，高于加蘭他敏的有11 個化合物，高于卡巴拉汀的有15 個化合物，高于美金剛的有19 個化合物。結果表明，多數黃精活性成分與網絡關鍵靶點具有較好的結合能力。

圖6 黃精活性成分與關鍵靶點對接得分熱圖

3 討論

目前，防治AD 的藥物多作用于單靶點，只能改善中輕度AD 的癥狀，并不能預防、終止和逆轉AD的進程的發展。中藥具有多靶點、多途徑作用的特點，對防治AD 這種復雜性疾病有其獨到的優勢，具有極大的潛力。已有動物實驗表明黃精多糖可以改善APP 轉基因小鼠海馬CA1 區突觸界面［13］，減少海馬神經元的凋亡［14］，可顯著改善AD 大鼠海馬的病理改變［15］。但是，其作用機制尚不明確。因此，本研究基于多成分、多靶點、多途徑的研究思路，應用網絡藥理學技術，分析黃精防治AD 的靶點，構建黃精防治AD 靶點的交互作用網絡，富集防治AD 相關的生物過程及信號通路，闡述黃精防治AD 的作用機制，為黃精的臨床應用以及推廣提供科學依據。

對黃精防治AD 的作用網絡與潛在機制的研究結果表明：黃精中可能有20 個成分對防治AD 有顯著效果，有研究證明apigenin 可以通過調節氧化還原失衡、抑制神經細胞凋亡等機制發揮神經保護作用［16］；異甘草素（isoliquiritigenin）可以通過促進或維持抗氧化能力和抑制神經炎癥來保護脂多糖誘導的認知障礙和神經元損傷［17］。此外，該文收集到66 個黃精防治AD 的靶點，表明黃精防治AD 是通過多成分、多靶點作用的結果。

從構建的PPI 網絡可知，黃精與AD 靶點存在密切作用關系，核心靶點有5 個，主要為EGFR、SRC、PTGS2、STAT3、MMP9。研究表明，PTGS2 基因也稱為環加氧酶2 基因（COX2），在中樞神經系統的炎性細胞中被普遍表達,可以通過抑制神經元凋亡和炎癥，同時促進AD 中的神經元生長［18］。有研究顯示，在AD 小鼠中STAT3 的表達會增加，可能與AD 的慢性炎性損傷相關，在AD 的發病過程中，STAT3 的活化可介導保護反應［19］。那么，黃精有可能是通過抑制炎癥反應，進而達到防治AD 的作用。

進一步對其進行GO 分析和KEGG 通路分析，GO 富集分析顯示，黃精防治AD 主要是通過炎癥反應、對無機物的反應、活性氧代謝過程、激酶活性的正調控以及對Aβ 的反應等生物過程發揮作用。KEGG 通路富集結果顯示，癌癥信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、內分泌抵抗以及5-羥色胺能突觸等是黃精防治AD 的主要通路。其中，排名靠前的5-羥色胺能突觸、NF-κB 信號通路與神經病變類疾病發病機制息息相關。研究表明，5-HT 受體5-HT6 活化時可增強抑制性的GABA 的功能產生，并因此降低膽堿能、谷氨酸能神經元的活性，從而改善認知障礙功能［20］。AD 患者腦神經細胞變性與NF-κB 信號通路的活化有關。NF-κB信號通路可激活淀粉樣蛋白通路以促進Aβ 的形成，同時也是炎癥和氧化應激反應的主要調節方式［21］，這也與GO 分析中的炎癥反應、對Aβ 的反應以及對氧化應激的反應等生物過程相符合。同時，黃酮類成分可以通過抑制氧化應激及清除自由基、減少Aβ 形成、抑制炎癥因子表達，從而有效阻斷AD 的疾病進展［22］。

綜上所述，本研究系統地分析了黃精防治AD的作用機制，揭示了黃精防治AD 的活性成分、作用網絡和潛在作用機制，證明了黃精防治AD 具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點。但是對于黃精防治AD 的具體作用靶點及通路仍需進行進一步實驗，本課題組后續將對黃精作用于AD 大鼠后的血液、腦組織進行分析，以研究黃精防治AD的活性成分、作用靶點及通路。