氧化鋅-QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒配方乳粉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考

管卓龍，彭 超

（武漢食品化妝品檢驗所，湖北武漢 430040）

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都屬于酰胺醇類抗生素[1]。它們的化學性質非常穩定，在使用過該藥物的動物組織中極易形成殘留，曾廣泛應用于食品性動物的疾病預防與治療，但是它們對人、畜有一定的毒副作用，如對骨髓造血機能有抑制作用，產生血液系統毒性誘發可逆性的血細胞減少、不可逆的再生障礙性貧血等[2-4]，尤其以致命的“灰嬰綜合癥”對嬰幼兒生命健康造成嚴重的威脅[5]。因此，許多國家已禁止將其應用于食品動物中，我國獸藥殘留限量標準GB 31650—2019[6]規定氯霉素為禁止使用的藥物，在動物源性食品中不得檢出；甲砜霉素、氟苯尼考在牛和羊等動物性食品中的限量分別為50 μg·kg-1、200～3 000 μg·kg-1，但規定泌乳期禁用。嬰幼兒配方乳粉的主要原料為牛奶或羊奶，導致乳粉中酰胺醇類抗生素存在安全風險。因此，建立嬰幼兒配方乳粉中酰胺醇類藥物殘留的快速準確定量分析方法具有重要的現實意義。

目前，液相色譜-質譜聯用法具有靈敏度高、特異性強、二級質譜可有效排除假陽性、分析通量高等優勢，在食品領域中應用最為廣泛。目前現行有效的國家標準[7-11]中用于酰胺醇類藥物殘留檢測的液相色譜-質譜法主要針對水產品、禽畜及其副產品和牛奶，檢測范圍有限，且有的只能檢測一種藥物，主要采用固相萃取技術凈化，試劑消耗大、檢測周期長，不適用于大批量樣品的快速檢測。QuEChERS前處理技術因快速、簡單、價廉、高效、耐用和安全已廣泛應用于食品安全領域，主要有C18、PSA和GCB等常用吸附劑，實驗發現常規QuEChERS方法在嬰幼兒配方乳粉中酰胺醇類藥物的分析檢測效果并不理想。

氧化鋅是一種化學性質穩定且具有寬能帶隙的新型吸附劑。由于鋅原子的不穩定性，外層電子共享可以形成強烈的分子間作用力，從而產生吸附效應[12]。氧化鋅粉末比表面積大、吸附容量大，在重金屬和有機物的吸附、農藥的測定中有一定程度的應用[13]。然而，很少有研究關注使用氧化鋅作為復雜食品基質的QuEChERS吸附劑。本研究使用新型吸附材料ZnO與C18作為QuEChERS吸附劑純化嬰幼兒配方乳粉樣品，結合HPLC-MS /MS的靈敏度高和特異性強等優點，有效降低了基質效應，建立了嬰幼兒配方乳粉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考快速準確分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

嬰幼兒配方粉25批次（8批次1段，8批次2段，9批次3段）均購于武漢本地商超。

1.2 試劑

氟苯尼考（Florfenicol，FFN）、甲砜霉素（Thiamphenicol,TAP）、氯 霉 素（Chloramphenicol，CAP）（純度均大于99.31%），德國Dr. Ehrenstorfer 公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）（40～60 μm），中國ANPEL公司；石墨化炭黑（Graphitized Carbon Black，GCB）（40～120 μm），中 國ANPEL公司；氧化鋅（Zinc oxide，ZnO）（分析純），天津市風船化學試劑公司；硅膠鍵合氧化鋯（Zirconia Separation，Z-Sep）（粉末），德國西格瑪奧德里奇公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈（色譜純），上海ANPEL公司；NaCl（分析純），上海國藥試劑公司。

1.3 設備

AB SCIEX Triple Quad 4500質譜儀，上海愛博才思分析儀器貿易有限公司；LC 30A液相色譜儀，日本島津公司；ALLEGRA 64R 離心機，美國貝克曼庫爾特公司；VXMNAL渦旋振蕩儀，常州奧豪斯儀器公司；SK8200LHC超聲波清洗器，上海科導超聲儀器公司；EFAA-DC24-RT氮吹儀，上海安譜實驗公司；Milli-Q超純水，USA Milipore公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液配制

準確稱取各標準物質5.0 mg，用乙腈定容至50 mL，使 各 目 標 物 濃 度 均 為100 μg·mL-1，于-18 ℃保存。定量分析時用空白基質溶液稀釋成0.05 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1和10.00 ng·mL-1的標準工作溶液。

1.4.2 樣品前處理

準確稱取1 g（精確至0.001 g）乳粉樣品于50 mL離心管中，加入3.0 mL水分散樣品，再加入10.0 mL乙腈，振蕩提取10 min，超聲提取10 min，加入1.0 g NaCl，渦旋混勻，4 ℃條件下4 000 r·min-1離心5 min，上清液全部轉移至12 mL離心管中，準確加入100 mg ZnO、20 mg C18，振蕩10 min后于4 ℃條件下4 000 r·min-1離心5 min，上清液氮氣吹干，用1.0 mL 10%乙腈水溶解殘渣，過0.22 μm尼龍濾膜，待測。

1.4.3 LC-MS儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱為Waters XBridge C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL；流速0.3 mL·min-1；流動相組成為A水，B乙腈。

（2）質譜參數。ESI負離子模式；多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓（IS） -4 500 V；氣簾氣（CUR）壓力40 psi；霧化氣（GS1）壓力50 psi；輔助加熱氣（GS2）壓力50 psi；碰 撞 氣 體（CAD）Medium；離子源溫度（TEM） 500 ℃。各目標化合物的質譜參數如表1所示。

表1 分析物的母離子、子離子等重要參數

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優化

獸藥殘留分析時常用的溶劑有乙腈、甲醇和乙酸乙酯等。為保證提取效率，乳粉中需先加少量水以達到分散基質的作用。本研究在添加3 mL水溶解乳粉樣品后，考察了10 mL乙腈、10 mL甲醇、10 mL乙酸乙酯對目標化合物的提取效率。由圖1可知，使用乙腈作為提取溶劑時，3種酰胺醇類藥物的回收率均高于其他兩種溶劑。甲醇提取時，提取液渾濁，不易與水分離且較黏稠；乙酸乙酯、乙腈作為提取試劑時，其共萃物都能與水分層，但乙酸乙酯脂溶性較強，導致奶粉乳化嚴重，使目標物回收率偏低；乙腈極性更強且具有沉淀蛋白作用。故該實驗最終選擇10 mL乙腈作為提取劑。

圖1 不同提取溶劑對目標物回收率的影響

2.2 凈化用吸附劑的選擇及其用量的確定

奶粉基質復雜，富含脂類、糖類、蛋白質和礦物質等干擾物質，痕量分析時易產生明顯的基質效應。本實驗考察了C18、PSA和GCB等常用凈化劑和新材料ZnO、Z-Sep等對目標化合物的凈化效果。實驗發現PSA、GCB和Z-Sep對甲砜霉素具有較強的吸附作用，回收率低，排除使用。采用C18和ZnO作為凈化劑時平均回收率分別為61.8%、81.4%。進一步考察C18和ZnO兩種吸附劑用量和組合對目標化合物的影響。由圖2可知，在20 mg C18和100 mg ZnO時凈化效果最佳，基質干擾最小，目標化合物的回收率均大于85%。因此，實驗最終采用20 mg C18+100 mg ZnO的組合吸附劑對樣品進行凈化。

圖2 不同凈化劑組合對目標物回收率的影響

2.3 基質效應

基質效應（Matrix Effect，ME）是液質譜聯用時普遍存在的情況，指樣品中基質組分對分析物的干擾，由共流出物干擾分析物離子化導致，分為基質抑制和增強效應。ME=基質標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率。當ME為0.85～1.15時，基質效應不明顯；當ME＞1.15時，存在基質增強效應；當ME＜0.85時，存在基質抑制效應[14]。本實驗采用優化的色譜分離和樣品凈化條件，由表2可知，在當前的實驗方法下，CAP （ME=0.98）和FFN（ME=0.92）基質效應不明顯，TAP（ME=0.71）存在基質抑制效應，故本研究采用基質匹配標準曲線進行定量分析。

表2 3種目標物的標準曲線和基質效應

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質溶液配制質量濃度為0.05～10.00 ng·mL-1的系列混合標準工作溶液，按本實驗確定的條件進行測定，以各目標物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，3種目標物線性關系良好，相關系數均大于0.999（表2）。對加標樣品進行測定，分別以3倍信噪比（S/N）計算檢出限，以10倍信噪比（S/N）計算定量限，實驗測得3種目標物檢出限均為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1。3種目標物的提取離子流圖如圖3所示。

圖3 嬰幼兒配方乳粉基質標準溶液的提取離子流圖

2.5 回收率和精密度

取空白奶粉樣品，進行加標回收實驗，添加濃度分別為LOQ、2 LOQ、10 LOQ，每個濃度均為6平行實驗，以考察方法的回收率和精密度（以相對標準偏差表示RSD）。由表3可知，3種目標物的平均回收率為83.62%～96.45%，相對標準偏差為1.21%～9.46%，方法回收率穩定，精密度高，完全滿足嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類抗生素污染監測的要求。

表3 分析物的加標回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品的測定

采用建立的方法測定了25批次嬰幼兒配方乳粉樣品（8批次1段嬰兒配方奶粉，8批次2段幼兒配方奶粉，9批次3段幼兒配方奶粉），CAP和TAP均為未檢出，2批次3段乳粉中檢出FFN，測定值分別為0.124 μg·kg-1、0.112 μg·kg-1。為進一步驗證，采用國家標準《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）[7]對陽性樣品進行復測，結果分別為0.119 μg·kg-1、0.115 μg·kg-1，偏差分別為4.20%、-2.61%，表明建立的方法適用于嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類抗生素的測定。

3 結論

嬰幼兒是食品敏感性高的特殊群體，嬰幼兒配方乳粉又是其主要膳食營養來源之一，該產品中若檢出抗生素氟苯尼考，存在較大的食品安全風險問題。針對嬰幼兒配方乳粉基質特點，克服傳統固相萃取凈化耗時長、溶劑消耗大等問題。本研究以乙腈為提取溶劑，以100 mg ZnO+20 mg C18為吸附劑，采用基質匹配標準曲線定量，建立了氧化鋅QuEChERS前處理技術同時快速測定嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類藥物殘留的高效液相色譜-串聯質譜法。實驗表明，該方法具有快速、靈敏、準確度高等優點，可以很好地滿足嬰幼兒配方乳粉生產企業的出廠檢測需求，同時也可應用于生產企業對原料乳的質量把關，對于乳粉行業的日常風險監測具有一定的應用價值。