一種龍須菜中純化藻紅蛋白的新方法

崔佳敏，李 敏，左 旸，蒲 洋

（魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東煙臺 264000）

藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）作為一種重要的藻膽蛋白，是紅藻、藍(lán)藻光合作用的捕光色素蛋白之一[1-2]。水溶性的PE作為天然色素在食品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域和染料領(lǐng)域等具有廣泛的應(yīng)用[3]。同時PE獨特的光學(xué)特性能夠用于熒光標(biāo)記探針、光敏材料等的制作[4-5]。不同純度（Aλmax/A280）的PE用途不同，食品級純度大于0.7，藥品級純度大于3.0，PE的純度在極大程度上決定了其價值[6]。

龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）作為實現(xiàn)了南北方海域大規(guī)模人工栽培的江蘺科（Gracilariaceae）海洋紅藻，富含紅藻多糖和多種有益營養(yǎng)物質(zhì)，不僅具有水域生態(tài)修復(fù)功能，還是提取瓊膠的優(yōu)良原材料和具有高保健價值的天然食品[7-8]。作為我國人工栽培規(guī)模名列前茅的大型經(jīng)濟海藻，目前主要用于瓊膠制取和食用，其潛在的經(jīng)濟價值有待進一步開發(fā)[9-10]。其中富含的PE為三峰型的Ⅰ型R-PE，可見光區(qū)吸收光譜中，于498 nm、540 nm和565 nm有3個明顯吸收峰，且最大峰值位于565 nm處[11]；多波長的激發(fā)光激發(fā)，都會獲得580 nm為最大峰的特征熒光發(fā)射光譜。截至目前，這種高價值的PE還未被很好地開發(fā)和利用。

PE的純化方法決定了其純度以及經(jīng)濟價值，也對其進一步的開發(fā)和利用有決定性作用。目前國內(nèi)外報道了很多分離純化龍須菜中所含蛋白質(zhì)的工藝，主要包括細(xì)胞破碎、硫酸銨分餾及柱層析等步驟[12-13]。破碎細(xì)胞的方法主要包括超聲破碎、組織搗碎、反復(fù)凍融法和溶脹法等；得到組織破碎液后，再通過硫酸銨分級沉淀、等電點沉淀和超濾等方法進行粗提；最后綜合利用羥基磷灰石、分子篩（Sephadex G-100）、離子交換（DEAE-Sepharose Fast Flow）等層析介質(zhì)進一步純化PE[14-16]。但通過疏水層析介質(zhì)純化龍須菜PE的方案還未見報道。

本研究在低溫下，采用組織勻漿機破碎采集的龍須菜藻體，硫酸銨沉淀后用磷酸鹽緩沖液重懸得到PE二次粗提液，再依次運用疏水層析介質(zhì)和分子篩層析介質(zhì)進行PE純化，獲得藥品級純度的最終產(chǎn)品。此創(chuàng)新性純化工藝的應(yīng)用，為龍須菜PE的高值化產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜來自廣東汕頭南澳島，清水清洗多遍去除表面污泥與石沙，-20 ℃冷凍備用。Na2HPO4（國藥集團產(chǎn)品）；NaH2PO4（國藥集團產(chǎn)品）；(NH4)2SO4（國藥集團產(chǎn)品）。

1.2 粗提

本研究采用組織破碎法對龍須菜進行細(xì)胞破碎。把清洗干凈的龍須菜瀝干水分后剪碎，并置于-20 ℃。將冷凍的龍須菜放入組織勻漿機，少量多次加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，在4 ℃條件下進行勻漿破碎，3層紗布過濾后，經(jīng)12 000 r·min-1離心20 min，所獲上清即為PE粗提液。

1.3 (NH4)2SO4初步純化

粗提液中加入（NH4)2SO4使溶液飽和度達(dá)到20 %，4 ℃靜置2 h，之后4 ℃環(huán)境下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液繼續(xù)添加(NH4)2SO4使溶液飽和度達(dá)到45%，4 ℃靜置2 h，之后4 ℃環(huán)境下12 000 r·min-1離心20 min。取沉淀后用磷酸鹽緩沖液重懸，將含有PE的硫酸銨二次粗提液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.4 疏水層析

使用疏水層析介質(zhì)（Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，GE，USA），通過含有2.5 mol·L-1(NH4)2SO4，pH值為6.8的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液平衡3個柱體積。0.22 μm濾膜過濾后的二次粗提液用于上樣，并使用柱平衡緩沖液作為流動相，使目的蛋白與疏水柱介質(zhì)結(jié)合，流速為2 mL·min-1，共3個柱體積。隨后使用3個柱體積量，含有1.0 mol·L-1(NH4)2SO4的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液洗雜，同時用核酸蛋白檢測儀測定洗脫曲線，直至吸光值不再變化，最后20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液洗脫并收集純化后的目標(biāo)PE。

1.5 分子篩層析

使用分子篩層析介質(zhì)（Sephadex G-100），以pH值為6.8的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液平衡3個柱體積，緩慢加入上述疏水層析得到的樣品，以500 μL·min-1的流量進行洗脫，約40 min后開始收集PE洗脫液。龍須菜PE分離純化流程圖見圖1。

圖1 龍須菜PE分離純化流程圖

1.6 純度測定

龍須菜中PE的最大特征吸收峰為565 nm，PE純度表示為Amaxpeak/A280[17-20]。

1.7 SDS-PAGE電泳檢測

將粗提液和最終純化得到的高純度PE進行SDS-PAGE電泳檢測。先通過20 mmol·L-1ZnSO4溶液染色20 min后，于紫外光下，拍攝熒光圖像，再用考馬斯亮藍(lán)G250染液染色20 min，脫色后拍照，檢測PE條帶的特性[21-22]。

1.8 紫外可見光光譜測定

使用紫外可見光分光光度計（Denovix，USA）對PE樣品進行光譜掃描，光徑1 cm，掃描范圍為

250～700 nm[23-24]。

1.9 熒光發(fā)射光譜測定

使用熒光分光光度計（Agilent，USA）對PE樣品進行熒光發(fā)射光譜測定，應(yīng)用436 nm和545 nm波長激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PE的層析純化

對龍須菜進行破碎處理，離心后得到純度為0.05的蛋白粗提液（表1）。首先用飽和度為20%的(NH4)2SO4進行后續(xù)處理，上清液中的PE純度達(dá)到0.06。在之前的研究中，付曉蘋等[27]用紅毛藻分離純化PE，(NH4)2SO4沉淀溶液的純度比PE粗提液的純度增幅為229%。王盛等[17]用珊瑚藻分離純化PE，(NH4)2SO4沉淀溶液的純度比PE粗提液的純度增幅為161%。為進一步提高PE的純度，將經(jīng)20%(NH4)2SO4處理所得上清液的硫酸銨飽和度提升到45%獲取沉淀，用磷酸鹽緩沖液重懸后測得純度為0.77。經(jīng)疏水柱層析處理，洗脫后的PE，純度大幅度增加到了3.01。再經(jīng)分子篩層析洗脫后，最終獲得的高純度PE純度達(dá)到3.80。

表1 各步驟所得PE純度

20 % (NH4)2SO4沉淀所得PE上清液，在疏水層析的梯度洗脫中得到的洗脫圖譜（A280），純化過程中共有2個明顯的洗脫峰（圖2）：第1個洗脫峰較小，主要是流動相為結(jié)合緩沖時，PE與輸水介質(zhì)結(jié)合過程中，未結(jié)合的無色雜蛋白，結(jié)合過程同時具有洗雜的效果；第2個洗脫峰是用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液洗脫，所得的紅色部分，即目的PE。

圖2 PE的疏水柱層析洗脫圖譜圖

2.2 PE可見光光譜特征

圖3為粗提液和最終洗脫液中PE的吸收光譜圖。由結(jié)果可知，經(jīng)疏水柱-分子篩柱層析洗脫得到的PE，可見光區(qū)吸收在565 nm和498 nm處有完全吸收峰，在535 nm處有肩峰，其中565 nm處為最大吸收峰[28]。最終得到的高純度PE的可見光吸收光譜特征與文獻(xiàn)報道的一致[19-20,25,29]。對比粗提液中的PE在565 nm和498 nm處特征吸收峰強度較低，峰型不明顯。則進一步證明，經(jīng)疏水柱-分子篩柱層析，PE純度得到了極大的提高。

圖3 PE可見光光譜圖

2.3 SDS-PAGE電泳鑒定

通過SDS-PAGE對得到的PE進行進一步分析驗證，實驗結(jié)果如圖4所示，其中圖4（a）為紫外光下Zn2+加強的熒光自顯影結(jié)果，圖4（b）為考馬斯亮藍(lán)G250染色后的條帶。通過兩者相互印證，最終純度為3.80的PE（泳道A和C）在預(yù)計的位置共有3條帶，相對分子質(zhì)量從小到大分別約為12 kDa、17 kDa和35 kDa。這與報道的R-PE的α和β亞基大小在15～25 kDa，35 kDa處條帶為PE的γ亞基的結(jié)果一致[23,30]。而PE粗提液電泳結(jié)果中（泳道B和D），除了相同位置的3條能夠發(fā)射熒光的條帶外，仍然含有大量的其他雜蛋白條帶，這進一步證明了最終得到的PE達(dá)到了所需的高純度。

圖4 PE的SDS-PAGE電泳圖

2.4 熒光發(fā)射光譜特征

熒光發(fā)射光譜能夠用于驗證其光能傳遞特性。粗提液和最終純化得到的PE，分別用436 nm和545 nm波長的光激發(fā)，最大熒光發(fā)射峰都位于578 nm處（圖5）。與之前報道結(jié)果相似，表明純化后的PE基本保持了完整的分子結(jié)構(gòu)和光能傳遞性能[14]。熒光發(fā)射光譜除了反映藻膽蛋白內(nèi)部能量轉(zhuǎn)移的能力，也可用來識別強特異性的色基分子量子態(tài)。檢測到的熒光特性同時表明，新純化方法得到的R-PE能夠正確完成能量傳遞功能[31-32]。同時由于結(jié)構(gòu)對功能的決定作用，這一結(jié)果能夠反向證明R-PE中色基所處的蛋白微環(huán)境和量子態(tài)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，進一步證明了這一新純化方法的可靠性。

圖5 PE熒光發(fā)射光譜圖

2.5 Gauss解疊

為了更進一步驗證純化得到的R-PE保持了天然的光學(xué)活性，對純化后PE的吸收光譜進行Gauss解疊運算[25]。如圖6（a）所示，總共得到3個峰，分別對應(yīng)吸收光譜的3處吸收峰（498 nm、535 nm、565 nm）。Gauss解疊的R2為0.994 12，結(jié)果可信度高，與組成R-PE不同種類色基的吸收光譜相吻合。545 nm波長激發(fā)得到的熒光發(fā)射圖譜的解疊結(jié)果如圖6（b）所示，解疊后得到分別位于578 nm和618 nm處的兩個峰，Gauss解疊得到的R2為0.997 15。可見光吸收光譜和熒光發(fā)射光譜解疊后的理論計算驗證也確證了其天然的光學(xué)活性沒有發(fā)生改變。

圖6 PE可見光和熒光發(fā)射光譜解疊圖

3 結(jié)論

目前從不同藻類植物中分離純化PE的方法有很多報道，不同的純化方法有其各自的優(yōu)缺點。本論文從龍須菜中獲得粗提液，用分級(NH4)2SO4初步純化，再通過疏水柱-分子篩柱層析，獲得藥品級純度的R-PE。此外，通過紫外可見光吸收光譜、SDS-PAGE、熒光發(fā)射光譜以及Gauss解疊運算分析方法，驗證了該純化工藝的可行性。通過與已有報道對比驗證，證明純化后的R-PE保持了天然的光學(xué)活性，且蛋白結(jié)構(gòu)也未發(fā)生改變。與之前報道的分離方法相比，此方法的優(yōu)點在于分離純化工藝簡潔，且同樣具有良好的分離效果。