腎細(xì)胞癌患者外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平及臨床意義

林 鋒，張 黎，王彩燕

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，福建廈門 361003

腎細(xì)胞癌(RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，腎透明細(xì)胞癌約占所有RCC的80%，是RCC最常見的組織學(xué)類型[1-2]。由于RCC對(duì)常規(guī)的放療、化療不敏感，近年來，對(duì)RCC患者進(jìn)行免疫靶點(diǎn)的治療成為臨床研究中的熱點(diǎn)。T淋巴細(xì)胞作為抗腫瘤免疫的主要細(xì)胞已被用于RCC的治療[3]。程序性死亡受體-1(PD-1)作為一種重要的免疫抑制分子，當(dāng)T淋巴細(xì)胞表面的PD-1受體與腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體-1(PD-L1)結(jié)合后，會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤的作用[4]。既往有研究表明RCC患者中PD-1高表達(dá)能夠?qū)е旅庖咭种菩阅[瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，不利于RCC患者的預(yù)后[5-6]。增殖細(xì)胞核抗原Ki-67是一種反映細(xì)胞增殖活性的核蛋白抗原，通過激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2/細(xì)胞周期蛋白E通路，加速G1/S期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，Ki-67已被證實(shí)可作為多種腫瘤細(xì)胞的增殖標(biāo)志物[7]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞及其表面PD-1的水平情況，結(jié)合增殖細(xì)胞核抗原Ki-67水平，分析RCC患者的免疫狀況，以期用靈敏、高效的方法為RCC患者的早期診斷及預(yù)后提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年4月至2022年5月于本院初診為RCC的42例患者(RCC組)的臨床資料，其中男35例，女7例；年齡13～82歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期3例；病理分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)33例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)9例；病理類型：透明細(xì)胞癌33例，其他類型9例(包括未分類RCC 5例、嫌色細(xì)胞癌1例、腎母細(xì)胞癌1例、乳頭狀細(xì)胞癌2例)；腫瘤位置：左腎18例，右腎24例；選取同期45例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男32例，女13例，年齡18～69歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》，并獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

1.2儀器與試劑 所用熒光單克隆抗體：FITC標(biāo)記CD4、PE標(biāo)記CD8；檢測(cè)儀器、檢測(cè)軟件及數(shù)據(jù)分析采用美國BD公司的FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀、Diva 自動(dòng)上機(jī)軟件。

1.3方法

1.3.1一般資料收集 記錄所有RCC患者的性別、年齡、臨床分期、病理分級(jí)、腫瘤最大徑、位置和增殖細(xì)胞核抗原Ki-67的水平，分析外周血T淋巴細(xì)胞水平及T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與臨床病理特征的關(guān)系。

1.3.2T淋巴細(xì)胞比例及其表面PD-1水平檢測(cè) 清晨采集受試者空腹靜脈血3 mL于含肝素鈉抗凝劑的采血管中，處理前充分混勻。在流式管底部加入10 μL PD-1檢測(cè)試劑，吸取100 μL混勻的外周血標(biāo)本，加入管底，避免標(biāo)本碰到管壁上部；輕輕渦動(dòng)混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；向管內(nèi)加入2 mL 1×溶血素，輕輕渦動(dòng)混勻，室溫避光孵育10 min；300×g離心5 min，棄上清液；向管內(nèi)加入 2～3 mL磷酸鹽緩沖液，渦動(dòng)混勻，300×g離心5 min，棄上清液；向管內(nèi)加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液并完全混合，上機(jī)檢測(cè)。采用FSC/SSC雙參數(shù)設(shè)門，獲取1×105個(gè)淋巴細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子水平的不同，流式細(xì)胞儀可以分辨出各種不同的細(xì)胞，并計(jì)算出CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+。

2 結(jié) 果

2.1兩組T淋巴細(xì)胞比較 與對(duì)照組比較，RCC組CD8+T淋巴細(xì)胞百分比升高，CD4+/CD8+降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.20)。見表1。

表1 兩組T淋巴細(xì)胞比較

2.2兩組T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平比較 與對(duì)照組比較，RCC組CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組T淋巴細(xì)胞表面PD-1的水平比較

2.3外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 RCC患者中，外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1的水平與患者的年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期、腫瘤最大徑、腫瘤位置、病理類型均無關(guān)(P>0.05)，而與組織中Ki-67水平有關(guān)，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)。見表3。

表3 外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表3 外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞的浸潤和免疫分子的調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，腫瘤微環(huán)境包括由CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞組成[8]。RCC被認(rèn)為是一種免疫原性腫瘤，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤是RCC預(yù)后的重要因素[9]。目前關(guān)于RCC免疫功能的研究不多且說法不一，有研究報(bào)道RCC腫瘤組織中CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的高度浸潤與腫瘤較高的分級(jí)和較短的患者生存期有關(guān)[10]。有研究表明，增加CD4+腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，聯(lián)合抗PD-1治療能夠緩解RCC患者病情[11]。因此，深入研究RCC患者的免疫細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)對(duì)RCC的診斷治療意義重大。本研究結(jié)果表明，RCC組外周血CD8+T淋巴細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯升高，CD4+/CD8+較對(duì)照組明顯降低，RCC患者外周血中存在T淋巴細(xì)胞水平失衡，提示RCC患者處于免疫抑制狀態(tài)。

PD-1屬于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，為CD28/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4/誘導(dǎo)性共刺激分子受體家族的成員，主要表達(dá)于腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞表面[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PD-1除了可以在腫瘤組織表達(dá)外，還以可溶性形式存在于外周血中[13]。由于腫瘤組織標(biāo)本來源困難不能實(shí)現(xiàn)多次檢測(cè)，動(dòng)態(tài)觀察的目的，因此，通過檢測(cè)腫瘤患者外周血PD-1水平反映患者的免疫狀態(tài)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，RCC組外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過對(duì)RCC患者PD-1水平的多次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有助于臨床醫(yī)生對(duì)患者病程進(jìn)展、治療方案及效果做出及時(shí)準(zhǔn)確的評(píng)估。

Ki-67作為一種評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的核抗原，其水平指數(shù)可以獨(dú)立預(yù)測(cè)癌癥的進(jìn)展。既往研究認(rèn)為Ki-67在RCC患者中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值較高，高水平Ki-67的RCC患者具有較高的臨床病理分級(jí)及較短的生存期[14]。Ki-67可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而過快的腫瘤細(xì)胞增殖可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中糖酵解產(chǎn)生的乳酸堆積，從而致使調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞上的PD-1水平升高[15]。本研究結(jié)果表明，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)，預(yù)示著二者聯(lián)合檢測(cè)能更好地預(yù)測(cè)RCC的進(jìn)展和分期。Ki-67通過參與細(xì)胞周期調(diào)控來促進(jìn)腫瘤增殖，而PD-1/PD-L1軸可通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化[16]。因此，PD-1與Ki-67對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控是否存在潛在聯(lián)系值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，RCC患者外周血中存在CD8+T淋巴細(xì)胞百分比升高，CD4+/CD8+降低；RCC組PD-1水平的升高與腫瘤組織中Ki-67水平有關(guān)。外周血T淋巴細(xì)胞及其表面PD-1水平檢測(cè)可以更好地幫助判斷RCC患者的免疫狀態(tài)及預(yù)后。但本研究存在一定的局限：RCC組的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期數(shù)量太少，一定程度上影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果；期待后期大樣本研究能更好地呈現(xiàn)外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。