即食食品中6種致病菌恒溫熒光快速檢測方法的建立及應用

◎ 黃小真

（福州市產品質量檢驗所，福建 福州 350008）

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌是6 種常見的食源性致病菌，是國家食品安全監督抽檢和食品風險監測判定微生物污染的6 個重要指標項目，2022 版國家食品安全監督抽檢實施細則、GB 29921—2021、GB 31607—2021 以及GB 19298—2014 對即食食品中以上6 種致病菌進行了規定[1-4]。目前這6 種致病菌的檢測方法還是傳統的國標培養法，步驟煩瑣，耗時長，完成6 種致病菌的檢測通常需要3～7 d，不能滿足食品制售企業和市場監督檢驗部門快速檢測的要求，無法及時評價膳食風險。利用PCR技術同時快速檢測即食食品中該6 種致病菌的方法可供參考甚少[5-7]。因此，建立一種可同時快速檢測大批量食品中多種致病菌的方法是食品微生物檢測研究的方向。

本項目針對即食食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種致病菌，設計前增菌方法、選擇Bst 聚合酶及特異性引物，采用一個恒溫擴增條件，進行特異性試驗和靈敏度試驗，同時將該方法應用于市售食品樣品的檢測，建立一種快速檢測即食食品中6 種致病菌的恒溫熒光法，為食品安全快速檢測和風險評估提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

沙門氏菌（ATCC14028）、金黃色葡萄球菌（ATCC8538）、單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、蠟樣芽孢桿菌[CMCC（B）63303]以及銅綠假單胞菌（ATCC27853）6 株標準菌株購自北京陸橋技術股份有限公司；12 份市售食品樣品包括包裝飲用水、巴氏鮮奶、什錦谷物粉、瑞士卷、全脂高鈣羊奶粉、冰淇淋、鮮蝦沙拉、涼拌牛肉、生食三文魚魚段、鮮切芒果、檸檬無骨雞爪以及海鮮壽司拼盤。

1.2 試劑與培養基

細菌基因組DNA 快速提取試劑盒；沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種核酸檢測試劑盒，均購自廣州迪奧生物科技有限公司；緩沖蛋白胨水（BPW）、7.5%氯化鈉肉湯、LB1增菌液、3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、SCDLP 增菌液以及營養瓊脂等培養基均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 儀器

ABI 7500Fast 實時熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SHP-250 生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；Telstar Bio Ⅱ Advance 生物安全柜，泰事達機電設備（上海）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品預增菌

在潔凈室中，分別稱取25 g（mL）食品樣品放入盛有225 mL 增菌液的無菌均質袋中，以10 000 r·min-1均質1 min 后進行培養，增菌液和培養條件見表1。

表1 6 種致病菌增菌液和培養條件表

1.4.2 細菌DNA 模板的制備

將增菌液搖勻，取100 μL 轉移至預裝900 μL DNA提取液的DNA 提取管中，渦旋振蕩混勻，100 ℃條件下熱浴10 min，室溫放置10 min，完成后的上清液即為提取的核酸基因組。10 000 r·min-1離心2 min，將上清液轉移至新的離心管中，可-20 ℃保存備用。

1.4.3 反應體系配制

根據6 種致病菌核酸檢測試劑盒說明書配制反應體系，加入96 孔樣品板中：每個待檢樣品需反應液22 μL，Bst聚合酶1.0 μL，密封液20 μL，DNA模板2 μL，每個反應體系25 μL。

1.4.4 恒溫擴增反應

將配制好的反應體系混合后，10 000 r·min-1離心30 s，立即放入ABI 7500Fast 熒光PCR 儀進行恒溫擴增，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，設置反應程序，將63 ℃ 15 s、63 ℃ 45 s 作為一個循環，于63 ℃ 45 s 處收集熒光信號，共45 個循環。

1.4.5 特異性試驗

取實驗室儲存的6 種致病菌標準菌株復活培養，提取相應DNA 模板，用恒溫熒光法檢測，6 種致病菌各自空白增菌液作為陰性對照，驗證該方法的特異性。

1.4.6 靈敏度試驗

按表1前處理增菌方法，將各自菌液10 倍梯度稀釋至10-9，每個稀釋度取1 mL 進行營養瓊脂培養平板計數，每個稀釋度進行3 個重復。同時，選擇3個合適稀釋度（102～104）CFU·mL-1的菌液，各取1 mL進行DNA 提取后用恒溫熒光法檢測，驗證該方法的靈敏度。

1.4.7 食品樣品檢測試驗

用恒溫熒光法同時檢測12 份市售即食食品中的6種致病菌，同時按照GB 4789 系列國標方法[8-13]進行檢測，比較兩種方法檢測結果的一致性和時效性。采用人工污染樣品方法，分別取經過平板計數確定濃度為103CFU·mL-1的6 種致病菌純菌菌液1 mL 加入12份市售食品樣品中，用恒溫熒光法檢測，驗證樣品陽性檢出率。試驗方案見表2、表3。

表2 12 份市售即食食品試驗方案表

表3 96 孔樣品板試驗方案樣品編號表

2 結果與分析

2.1 方法特異性

采用恒溫熒光法對6 種致病菌純培養物進行檢測，6 種致病菌均有相對應的特異性擴增曲線，陰性對照均無擴增曲線。陰陽性結果準確率為100%。因此，該試驗建立的恒溫熒光法特異性強。6 種致病菌恒溫熒光擴增圖譜見圖1、表4。

圖1 6 種致病菌恒溫熒光擴增圖譜圖

表4 96 孔樣品板試驗結果表（Ct 值）

2.2 方法靈敏度

經過營養瓊脂培養平板計數確定后，原始純菌菌液經過10 倍梯度稀釋后，選取菌液濃度（102～104）CFU·mL-13 個稀釋度用恒溫熒光法檢測，該方法檢測6 種純菌靈敏度均達到103CFU·mL-1。

2.3 市售食品樣品檢測

12 份即食食品購于超市，有固體樣品、半固體樣品、液體樣品，包括預包裝食品、散裝速食方便食品和鮮切水果等，分別采用恒溫熒光法和國標培養法同時檢測6 種致病菌。通過恒溫熒光法和國標培養法檢測發現，12 份樣品檢測結果均為陰性，12 份人工污染樣品檢出陽性菌，恒溫熒光法與國標培養法檢測結果一致性達到100%。針對12 份市售即食食品同時檢測6 種致病菌，從樣品制備到檢測結果數據報送，恒溫熒光法檢測全過程耗時24 h，國標培養法檢測全過程耗時7 d。

3 結論與討論

本研究建立了即食食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種致病菌同時快速檢測恒溫熒光法，該方法特異性強，對食品基質無特殊要求，檢測靈敏度達到103CFU·mL-1，操作簡單，檢測結果穩定可靠。實際檢測工作中遇到的食品樣品復雜多樣，需要檢測的目標菌種類繁多，該方法基于96 孔樣品板和相同的儀器試驗條件，可滿足同時檢測不同食品樣品的多種目標菌，極大地提高了檢測效率，可用于食品安全突發事件應急檢測。