高效液相色譜法測定釀酒葡萄中單寧酸的含量

◎ 張學玲，劉 霞，蔣 媛，葛 謙，董 川，牛 艷，王曉菁

（1.寧夏回族自治區食品檢測研究院，國家市場監管重點實驗室（枸杞和葡萄酒質量安全），寧夏 銀川 750002；2.寧夏回族自治區農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002；3.寧夏回族自治區農產品質量安全標準研究與評價重點實驗室，寧夏 銀川 750002）

葡萄產業是寧夏農業發展的優勢特色產業和自治區六大支柱產業之一，已初步形成規模化。釀酒葡萄因皮厚、果肉少、汁多、糖分含量高、種子較大、單寧含量高而被用于葡萄酒的釀造。在葡萄酒中，單寧的數量、種類對葡萄酒的口感、結構、風味以及營養價值均具有重要的影響[1]。研究表明，單寧可以穩定紅葡萄酒的色素，使其保持鮮活的顏色，也能使酒體更加堅實飽滿、余味持久[2]。單寧不僅可以保護葡萄本身的天然花色苷，還可以防止花色苷被氧化，對pH、氧氣和二氧化硫更為穩定[3]。單寧作為紅葡萄酒的骨架，能在感官上帶來苦味和澀味，欠缺單寧的葡萄酒往往瘦弱寡淡，風味不足。

單寧酸又稱鞣酸、單寧或丹寧酸，化學式為C76H52O46，是一種天然的多酚化合物。單寧酸含有的多酚基團具有很強的生理活性功能，能夠抗氧化[4-8]、抗菌[9-13]、收斂[14-15]、抗腫瘤和抗癌變[16-17]等，具有廣泛的應用價值[18]。

分光光度法[19-20]是檢測單寧酸的主要方法，但該方法測定的是以沒食子酸為主的單寧類化合物的總量，而非單寧酸含量。近年來，高效液相色譜法也逐漸被運用于樣品中單寧酸含量的測定中[21-22]，但相應報道較少，且關于釀酒葡萄中單寧酸含量的測定暫未見相關報道。因此，本文以寧夏產區釀酒葡萄為主要原料，采用振蕩輔助提取釀酒葡萄中單寧酸成分，通過前處理（提取試劑、提取體積、振蕩時間等）和儀器條件優化，建立了基于高效液相色譜法測定釀酒葡萄中單寧酸含量的方法，以期為完善寧夏地區釀酒葡萄質量標準體系構建提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2021年7—9月在賀蘭山東麓釀酒葡萄種植基地，采摘幼果期、收獲期釀酒葡萄。每次隨機于植株東、西兩側分別采集果穗各1 穗，共6 穗，采集品種7 種，包括霞多麗、雷司令、赤霞珠、蛇龍珠、西拉、馬瑟蘭和美樂。所采樣品去除異常果粒后經破壁料理機打漿，放置在-20 ℃冰箱中冷凍保存。

對照品單寧酸（CAS：1401-55-4，含量98%）；乙腈、甲醇、正己烷、丙酮（色譜純，美國默克公司）；磷酸(色譜純，美國天地公司)。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀-UV 檢測器（Waters e2695-2487，美國沃特世公司）；低速臺式大容量離心機（TDL-40B，上海安亭科學儀器廠）；振蕩器（THZ-82A，金壇榮華儀器公司）；高速勻漿機（T18 basic 型，德國IKA 公司）；電子天平（PL202-L 型，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；渦旋混合器（IKA MS 3 basic型，德國IKA 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm ）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1% 磷酸水溶液- 乙腈（95∶5，V∶V）；流速：0.8 mL·min-1；紫外檢測器波長：280 nm；進樣量：1 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取單寧酸對照品適量（精確至0.01 mg），置棕色小瓶中，用刻度吸管移10 mL 甲醇充分溶解，配制成質量濃度為1 000 mg·L-1的對照品儲備液，避光-18 ℃保存。每次取用時，準確移取適量的對照品儲備液，用甲醇定容，配制成所需系列濃度的標準工作溶液。

1.3.3 樣品提取

稱取釀酒葡萄樣品3.0 g 于50 mL 的離心管中，加入25 mL 8∶2（V∶V）甲醇溶液，振蕩20 min，于4 000 r·min-1離心3 min，經0.22 μm 的濾膜過濾后用于高效液相色譜儀分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

研究表明[22]，單寧酸的最大吸收波長為280 nm，故選擇該波長為液相紫外檢測器的檢測波長。選擇Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水為流動相，進行對比分析。結果表明，采用Ultimate AQ-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，可實現與干擾組的有效分離。該條件下單寧酸標準品為單一峰，且峰型對稱，相對保留時為11.910 min 左右，重現性好，單寧酸標準品色譜圖見圖1，釀酒葡萄中單寧酸色譜圖見圖2。

圖1 單寧酸標準品色譜圖

圖2 釀酒葡萄中單寧酸色譜圖

2.2 釀酒葡萄中單寧酸前處理方法的建立

2.2.1 提取試劑的優化

單寧酸具有較強的極性，極易溶于水和一些有機溶劑如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等，而在三氯甲烷、正己烷中均不溶，本文選取丙酮、乙酸乙酯、甲醇3 種有機試劑對釀酒葡萄中單寧酸進行提取。結果發現3 種試劑均能提取出釀酒葡萄中單寧酸成分，結合儀器色譜條件、試劑安全性使用及實驗操作方便性，選取甲醇作為提取劑。但實驗發現，以甲醇為提取劑時，單寧酸回收率較低，故進一步通過加標回收實驗對甲醇-水（體積比）進行優化，實驗結果見圖3。隨著提取體系中甲醇比例的增大，單寧酸回收率呈先上升后下降趨勢，甲醇-水的體積比為8∶2 時，單寧酸回收率最高，達92%。

圖3 不同比例甲醇-水（體積比）提取條件下釀酒葡萄中單寧酸的回收率圖

2.2.2 提取劑體積及振蕩時間的優化

釀酒葡萄稱樣量不變，考察提取劑體積、振蕩時間變化對單寧酸回收率的影響，結果見圖4、圖5。提取劑體積增大可以有效提高單寧酸的回收率，當提取劑體積≥25 mL 時，單寧酸的回收率均可以達到97%以上，考慮到有機試劑的有效合理使用，確定提取劑體積為25 mL。在前面優化的基礎上，改變振蕩提取時間，結果發現當振蕩時間≥20 min 時，單寧酸的回收率均能符合檢測方法要求，考慮到節能減耗，振蕩時間選取20 min。

圖4 不同提取體積下釀酒葡萄中單寧酸回收率圖

圖5 不同振蕩時間下釀酒葡萄中單寧酸回收率圖

2.3 標準曲線、檢出限、定量限

分別配制0.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、60.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1單寧酸標準溶液，按照已優化的色譜條件分別進樣，以單寧酸的峰面積對質量濃度作圖，繪制單寧酸線性標準曲線圖。曲線方程為y=2 736.9x-1 931.8，R為0.999 8，說明單寧酸濃度為0.5～100.0 mg·L-1時其線性關系良好。

稱樣量為1 g，定容體積為50 mL，以3 倍信噪比計算儀器檢出限，單寧酸的檢出限為0.2 mg·kg-1；采用加標回收實驗確定本方法中定量限為0.5 mg·kg-1。

2.4 穩定性實驗

取同一釀酒葡萄樣品提取液，將樣品在室溫下分別放置0 h、2 h、5 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 后，按已建立的色譜條件，采用高效液相對不同放置時間下的釀酒葡萄樣品提取液進行測定，根據單寧酸峰面積計算RSD 值。結果顯示RSD 值為2.6，表明供試品溶液在24 h 內的穩定性良好。

2.5 準確度與精密度

分別在釀酒葡萄基質中添加0.5 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1和20.0 mg·kg-14 個濃度水平的單寧酸標準溶液，每個水平重復5次，測定其回收率。由表1可知，在4 個濃度添加水平下，釀酒葡萄中單寧酸的平均回收率在88%～96%，相對標準偏差在0.7%～6.0%，符合檢測要求。

表1 釀酒葡萄中單寧酸的添加回收率和精密度結果表（n=5）

2.6 釀酒葡萄樣品中單寧酸含量的測定及差異性分析

采用已建立的釀酒葡萄中單寧酸檢測分析方法，對同一天采集的不同品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量進行測定，并采用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析，結果如圖6所示。

圖6 不同品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量圖

因品種差異，7 個品種釀酒葡萄幼果和成熟果中的單寧酸含量有極顯著差異性（P＜0.01）。幼果期，白葡萄中雷司令的單寧酸含量高于霞多麗；紅葡萄中西拉的單寧酸含量最高，表現為西拉（17.9 mg·kg-1）>馬瑟蘭（9.2 mg·kg-1）>美樂（7.2 mg·kg-1）>蛇龍珠（5.0 mg·kg-1）>赤霞珠（4.5 mg·kg-1）。經生育期變化，成熟果中單寧酸的含量累計增加遠高于幼果，白葡萄中雷司令單寧酸含量高于霞多麗，紅葡萄中西拉（164.2 mg·kg-1）>蛇龍珠（131.1 mg·kg-1）>赤霞珠（95.1 mg·kg-1）>馬瑟蘭（92.4 mg·kg-1）>美樂（72.3 mg·kg-1），與幼果相比存在差異。幼果到成熟果，單寧酸累計增長量表現為西拉（146.3 mg·kg-1）>蛇龍珠（126.1 mg·kg-1）>赤霞珠（90.6 mg·kg-1）>馬瑟蘭（83.2 mg·kg-1）> 美 樂（65.1 mg·kg-1）> 雷 司 令（33 mg·kg-1）>霞多麗（27.6 mg·kg-1）。白葡萄品種較紅葡萄品種，幼果果實中單寧酸含量差異不大，但經生育期變化至成熟果，單寧酸含量遠低于紅葡萄品種。

3 結論

通過前處理及儀器條件優化，建立了釀酒葡萄中單寧酸高效液相色譜分析法。結果表明單寧酸在濃度為 0.5～100 mg·L-1時，與響應值呈線性關系，相關系數R為0.999 8；單寧酸回收率在88%～96%，RSD值為0.7%～6.0%，定量限為0.5 mg·L-1，樣品在24 h內穩定，滿足分析檢測要求，可用于釀酒葡萄中單寧酸含量的測定。因品種差異，7 個品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量均存在極顯著差異（P＜0.01）。經生育期變化，各品種成熟果中單寧酸含量與幼果相比存在差異。幼果果實中白葡萄與紅葡萄單寧酸含量差異不大，但經生育期變化至成熟果，白葡萄中單寧酸含量遠低于紅葡萄品種。