濕生扁蕾不同提取部位對肺纖維化模型大鼠肺功能的影響

王俊麗 劉喜平 崔樹婷 景 明 施麗娟 朱中博 武妍琳 馬 泉

1.西寧聯勤保障中心藥品儀器監督檢驗站，青海 西寧 730050；2.甘肅中醫藥大學/甘肅省中醫方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州市婦幼保健院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種以彌散性肺泡炎和肺泡結構紊亂并最終發展為肺間質纖維化為特征的疾病[1]。目前抗肺纖維化的藥物吡非尼酮和尼達尼布已獲批上市，但藥物只能夠部分延緩肺纖維化患者肺功能的下降[2]。肺纖維化的病理機制較為復雜，單一靶點的藥物無法改善或逆轉肺纖維化的進程，目前仍缺乏被廣泛認可的有效藥物。探尋針對不同部位、不同靶點等多元化藥物的篩選成為研究的重要趨勢[3-4]。中草藥的多成分、多靶點、多途徑等特征成為抗肺纖維化藥物篩選的重要來源，其在改善肺功能及肺纖維化癥狀、提高生活質量等方面具有明顯的優勢[5]。

濕生扁蕾是龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Ma(GPM)的干燥全草，具有清熱解毒、鎮咳止痛、健脾止瀉等功效[6]，藏醫除用于肝炎、腸炎腹瀉外，也常用于流感、咳喘等呼吸系統疾病[7]。近年來研究發現濕生扁蕾在抗纖維化方面具有優勢[8]。并且發現濕生扁蕾所含化合物具有潛在的抗肺纖維化活性[9]，但其有效部位及藥理活性并不明確。本研究通過提取濕生扁蕾水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等不同極性溶劑的有效部位，觀察了這些不同極性溶劑提取部位對博來霉素誘導的肺纖維化大鼠肺功能及血氣的影響，以期為深入研究濕生扁蕾抗肺纖維化的有效部位及藥理活性奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用主要儀器有EV351旋轉蒸發儀-真空泵(萊伯泰科有限公司)；SB-5200DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PN 000A3747氣管插管工具盒(美國Braintree Scientific Inc公司)，PLT-ANS-MS小動物肺功能測試系統(美國EMKA科技有限公司)，GEM3500血氣分析儀(美國沃芬Instrumentation Laboratory)；L-600臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑 濕生扁蕾藥材采自甘肅省臨潭縣冶力關鎮，經甘肅中醫藥大學景明教授鑒定為龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Ma(GPM)的干燥全草。鹽酸博來霉素(北京索萊寶科技有限公司，批號2141026)，吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業有限公司，批號H20133376)，石油醚分析純、正丁醇分析純及乙酸乙酯分析純(天津市富宇精細化工有限公司，批號分別為20170522 、20170328、20170215)，蘇木素伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1120)，Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1340)。

1.3 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠64只，體質量(180±20)g，甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK(甘)2015-0002-0001382。飼養于甘肅中醫藥大學實驗中心，溫度24～26 ℃，相對濕度20%～30%，12 h/12 h晝夜交替環境，每天給予高壓滅菌墊料及滅菌飲用水，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 濕生扁蕾不同提取部位的制備 分別精密稱取濕生扁蕾藥材粉末500 g，分別加20倍量的純水、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚浸泡24 h，加熱煮沸后進行回流提取1次，每次提取時間3 h，提取液靜置過夜后去渣沉淀，最終獲得水提物84.576 g、乙醇提取部位77.794 g、乙酸乙酯提取部位27.874 g、正丁醇提取部位58.297 g、石油醚提取部位8.296 g。分別密封低溫保存，備用。各提取部位在給藥前用純水溶解，超聲處理10 min使之充分混懸，再用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成混懸液，生藥濃度分別為1.67 g/mL、2.50 g/mL、1.67 g/mL、1.00 g/mL、0.83 g/mL。

2.2 實驗分組及處理 64只SPF級Wistar雄性大鼠，適應性飼養7 d后，隨機分為實驗組和空白組。參考文獻[10]方法，對實驗組大鼠采用一次性硫酸博來霉素(5 mg/kg)氣管內注射誘導建立肺纖維化大鼠模型。待造模成功后，再將實驗組大鼠隨機分為7組，每組8只，分別為模型組、吡非尼酮組、Ⅰ組(水提部位組)、Ⅱ組(95%乙醇提取部位組)、Ⅲ組(乙酸乙酯提取部位組)、Ⅳ組(正丁醇提取部位組)、Ⅴ組(石油醚提取部位組)。模型建立成功后第2天開始，參照人與大鼠體表系數折算，按含濕生扁蕾生藥量4.2 g/kg-1灌胃給藥[11]，給藥體積均為5 mL/kg，空白組、模型組大鼠分別每日給予等量生理鹽水灌胃；吡非尼酮組大鼠每天按0.108 g/kg吡非尼酮(臨床成人推薦維持劑量為1200 mg/d)灌胃，1次/d，連續21 d。

2.3 大鼠肺功能測定 各組大鼠28 d后，按設備提供說明書調試儀器確認系統正常運行。選擇用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉狀態下無創肺功能測定，待大鼠進入深麻醉狀態即動物全身肌肉松弛、呼吸平順、角膜反射消失，行氣管插管，將氣管插管后的大鼠仰臥位置于體描箱，將氣管插管與體描箱氣路通道相連。打開計算機iox采集系統軟件，按照大鼠分組及編號設置數據儲存路徑，觀察氣道壓力曲線、氣道阻力曲線、肺容量曲線變化與動物呼吸機同步且平滑對稱，待曲線穩定后，設定每10 s生成一組呼吸波數據，采集5組數據。

2.4 大鼠血氣分析測定 肺功能檢測完畢后，腹腔注射10%水合氯醛加深麻醉大鼠后，沿前大鼠腹部正中線備皮消毒至下腹部，并用手術剪沿腹部正中線依次剪開皮層、肌層、腹膜，組織鑷將腹壁左右兩側拉開充分暴露大鼠腹腔內部，分離腹主動脈血。用一次性采血針針向近心端1～3 mm處方向刺入腹主動脈，另一端插入肝素抗凝管中收集血液。將測試包內置于血氣分析儀中，調試血氣分析儀運轉正常，設置溫度為37.0 ℃，設置參數O2(L/min)為1、FiO2%為2后檢測各組大鼠血氣值。

2.5 大鼠臟器系數觀察 肺功能檢測完畢及血液標本采集后，脫頸處死大鼠，每個時間點4只，打開腹腔取出脾臟，剔除脂肪組織及系膜；剪開胸腔，小心分離取出肺組織并剔除肺外氣管，生理鹽水沖洗表面血漬，吸水紙小心吸干臟器表面溶液，精密電子天平對臟器稱重并記錄。參考文獻[12]方法計算臟器系數，臟器系數=臟器質量(g)/動物體質量(g)×100%。

3 結果

3.1 濕生扁蕾不同提取部位對肺纖維化大鼠臟器系數的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺系數及脾系數明顯升高，具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾不同極性溶劑提取部位組肺系數、脾系數均有一定下降，其中以濕生扁蕾乙醇部位組肺系數下降最為明顯(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠臟器質量與臟器系數

3.2 濕生扁蕾不同提取部位對肺纖維化大鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組TV、EV、MV、PIF、PEF均顯著降低，f顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組、石油醚部位組中的TV、EV、MV、PIF、PEF均顯著升高(P<0.05)，濕生扁蕾乙酸乙酯部位組中的PEF升高(P<0.05)，濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、乙酸乙酯部位組、石油醚部位組中的f顯著降低(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠肺功能的變化

3.3 濕生扁蕾不同提取部位對肺纖維化大鼠小氣道功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠TI、TE、RT、Penh均顯著升高(P<0.01)，EF50、Cdyn均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾各組中TI、TE、RT、Penh均呈不同程度降低，Cdyn呈不同程度升高，其中以濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組中的TI及Cdyn顯著升高(P<0.01或P<0.05)，濕生扁蕾各組中TE顯著升高(P<0.01)，濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組、石油醚部位組中RT顯著升高(P<0.05)；濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、石油醚部位組Penh均降低(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組大鼠小氣道功能的變化

表4 各組大鼠動脈血氣的變化

4 討論

藏藥濕生扁蕾味苦、性寒，具有清熱解毒、鎮咳止痛等功效，常應用于肝炎、肝硬化、膽囊炎、潰瘍性結腸炎等消化系統疾病的治療。此外，民間也用于感冒發熱、流感、肺炎、急性咽喉炎、扁桃體炎等呼吸系統疾病。現代藥理學研究[13-14]顯示，濕生扁蕾不僅能夠抗腸纖維化，其所含黃酮類、有機酸等化合物亦具有抗肺纖維化活性作用，研究發現濕生扁蕾中含有的三萜類化合物熊果酸、齊墩果酸能夠降低SiO2誘導的矽肺纖維化模型大鼠TNF-α含量及膠原聚集，減緩大鼠矽肺纖維化的發展。濕生扁蕾中黃酮類化合物木犀草素對肺纖維化也有顯著改善作用[15]。然而，濕生扁蕾抗纖維化的活性部位并不明確。

本研究采用純水、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚不同極性溶劑對濕生扁蕾進行提取，獲得濕生扁蕾不同極性提取部位，建立博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型，表明濕生扁蕾不同極性提取部位均可增加大鼠體重、降低大鼠肺系數，其中以95%乙醇提取部位最為顯著，提示濕生扁蕾95%乙醇提取部位能減少因肺組織炎性滲出、纖維增生及膠原纖維沉積導致的肺質量增加。

肺功能是評估肺纖維化及臨床療效的重要指標[16]。TV、EV反應肺容積，PIF、PEF、MV反應通氣功能，當大鼠肺部纖維化時，小氣道內嗜酸性黏液分泌多，阻礙氣道通暢，引起通氣換氣功能障礙[17]。本實驗肺功能研究結果顯示，模型組大鼠TV、EV、MV、PIF、PEF均明顯降低，符合肺纖維化大鼠肺功能改變。經濕生扁蕾不同極性提取部位干預后TV、EV、MV、PIF、PEF指標均呈不同程度提高。綜合評判，以95%乙醇提取部位在改善肺纖維化大鼠肺功能方面最為顯著。

RT、TI、TE、EF50、Cdyn、Penh是反應小氣道功能的主要指標，其中RT、TI、TE取決于呼吸系統的順應性及氣道阻力，EF50%反應小氣道阻塞程度，Cdyn、Penh受氣道阻力的影響，反應肺組織彈性狀況。當肺纖維化時，肺泡上皮損傷導致肺泡結構損傷塌陷，纖維細胞增生，肺彈性回縮力降低，肺動態順應性出現降低，Penh與BLM誘導的肺纖維化大鼠肺功能有高度相關性[18]。本實驗研究結果顯示，模型組TI、TE、RT、Penh均升高，EF50、Cdyn均降低，提示小氣道功能障礙、順應性降低。濕生扁蕾各提取部位組TI、TE、RT、Penh呈不同程度降低，Cdyn呈不同程度升高，其中以濕生扁蕾95%乙醇提取部位改善效果最佳。而其中f與EF50指標變化不明顯，可能與麻醉狀態下大鼠呼吸肌、膈肌等功能處于松弛狀態有關。

課題組前期對于濕生扁蕾抗纖維化的相關研究[22]顯示，濕生扁蕾乙醇提取部位能明顯改善潰瘍性結腸炎引起的結腸纖維化，通過高效液相色譜法(HPLC)對濕生扁蕾乙醇提取物的血清藥物化學成分研究顯示，其中所含當藥黃素、當藥醇苷和木犀草素等通過抗炎、抗氧化而具有一定的抗纖維化作用[23]。本研究表明，濕生扁蕾不同極性部位提取部位均能改善博來霉素誘導的肺纖維化大鼠肺功能，而在血氣分析方面以乙醇提取部位最為顯著，推測乙醇提取部位可能是濕生扁蕾抗纖維化的有效部位，但是具體活性成分及其相關作用機制有待進一步探討。