鐵皮石斛花黃酮含量及其自由基清除力分析

農彥彥，吳子瑜，林詩堃，黃 敏，馮才敏

（順德職業技術學院 烹飪學院，廣東佛山 528333）

鐵皮石斛是近年來被大規模種植的《中華人民共和國藥典》中的名貴中藥材[1-2]。它能清肝、益胃、滋陰、潤肺[3]，但由于藥材和食材中主要使用的是鐵皮石斛的莖，隨著鐵皮石斛人工栽培技術的發展，鐵皮石斛花成為大量剩余的副產物[4-5]。目前有不少學者致力于研究鐵皮石斛花的多糖類化合物、黃酮類化合物、氨基酸等生物活性成分[6-7]和揮發性功效成分[8]，及這些成分的抗氧化活性及其降血糖、降血壓和調節免疫力等的功效[9-10]。如針對鐵皮石斛花抗氧化活性較強的黃酮類化合物，楊兵勛等[11]通過研究發現鐵皮石斛花具有與傳統抗氧化活性較強的黃酮類化合物——大豆異黃酮提取物相當的抗氧化活性。但分析不同花期鐵皮石斛花的自由基清除力及抗氧化活性的研究較少。因此，本試驗通過對不同花期石斛花黃酮含量及其自由基清除能力進行測定分析[12]，為產量急增的鐵皮石斛種植產業副產物——鐵皮石斛花資源的開發利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

鐵皮石斛花樣品由順德職業技術學院園林專業石斛組培課題組提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

1260 型高效液相色譜及二極管陣列檢測器（安捷倫科技有限公司）；LE204E/02 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-500 型高頻數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Lambda 25 型紫外分光光度計（天津博天勝達科技發展有限公司）。

1.2.2 試劑

蘆丁對照品（純度：95%）；甲醇（色譜純）；乙酸（色譜純）；七水硫酸亞鐵（分析純）、過氧化氫（分析純）、水楊酸（分析純）、Tris-HCl 緩沖溶液、鄰苯三酚（分析純）。

1.3 總黃酮含量的測定

1.3.1 蘆丁對照品溶液的制備

準確稱取適量蘆丁對照品，加甲醇制備成濃度為0.1 mg·mL-1的溶液。

1.3.2 供試樣品溶液的制備

準確稱取供試樣品粗粉1.000 g，同時準確量取50 mL 甲醇溶液，置于具塞錐形瓶中，稱定重量，用超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min 后，冷卻稱重，用甲醇溶液補足損失的重量，搖勻，過濾。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶0.5%乙酸（V∶V）為38∶62；流速：1 mL·min-1；進樣量：5 μL；檢測波長：385 nm。

1.4 羥自由基清除能力分析

1.4.1 樣品儲備液的制備

準確稱取0.488 g 待測樣品，用乙醇溶液定容至100 mL，得8 mmol·L-1樣品儲備液。

1.4.2 試劑空白

取25 mL 比色管，記為對照試驗組，依次向其中加入2 mL FeSO4溶液、0.1 mL 雙氧水溶液并搖勻，然后向其中加入0.1 mL 水楊酸，搖勻，用蒸餾水定容至25 mL，快速使用紫外分光光度計在波長為510 nm處檢測吸光度。設定為空白組，結果記為A0，具體加樣情況如表1所示。

1.4.3 不同濃度同花期樣品羥自由基清除力分析

取5 支潔凈的比色管，分別編號為1、2、3、4、5，依次向其中加入2 mL FeSO4溶液、0.1 mL 雙氧水溶液并搖勻，隨后分別加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 樣品儲備液定容至100 mL，振蕩搖勻，放入水浴鍋中，37 ℃溫水水浴15 min 后加入0.1 mL水楊酸，振蕩搖勻，蒸餾水定容至25 mL，快速使用紫外分光光度計測定510 nm 處的吸光度，結果記為Ax。同時做對照樣品對比（0.1 mg·mL-1蘆丁對照品）。

1.4.4 羥自由基清除率的計算

3 種黃酮類化合物羥自由基的清除率的計算公式為

式中：A0為對照（空白）試驗的吸光度值；Ax為待測樣品吸光度值；所有實驗結果是3 次測定數據的平均值。

1.5 超氧陰離子清除能力分析

1.5.1 樣品儲備液的制備

準確稱量0.610 g 待測樣品，用乙醇溶液定容至100 mL，得10 mmol·L-1樣品儲備液。

1.5.2 空白組的測定

取1 支潔凈比色管，加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液，置于25 ℃水浴中加熱20 min，加入1 mL 蒸餾水和0.4 mL 鄰苯三酚溶液，混勻后置于25 ℃水浴反應5 min，加入1 mL HCl 溶液終止反應，325 nm處的測定吸光度值，結果記為A0。

1.5.3 不同濃度同花期樣品超氧陰離子清除力分析

取5 支潔凈比色管，加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液，置于25 ℃水浴中加熱20 min，分別加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 的樣品儲備液定容至100 mL。再加入0.4 mL 鄰苯三酚溶液，混勻后置于25 ℃水浴中反應5 min，加入1 mL HCl 溶液終止反應，325 nm 處測定吸光度值，結果記為Ax，同時做對照樣品對比（0.1 mg·mL-1蘆丁對照品）

1.5.4 超氧陰離子清除率的計算

超氧陰離子清除率計算公式為

式中：A0為對照（空白）試驗的吸光度值；Ax為待測樣品吸光度值。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 樣品HPLC 圖譜分析

蘆丁對照品和供試鐵皮石斛花樣品溶液高效液相色譜分析圖譜（圖1、圖2），說明供試鐵皮石斛花中含有黃酮類化合物（以蘆丁計）。

圖1 蘆丁對照品譜圖

圖2 石斛花樣品譜圖

2.1.2 標準曲線

取蘆丁對照品溶液，進樣量為0.4 μL、0.8 μL、1.2 μL、1.6 μL 以及2.0 μL，以峰面積（A）為縱坐標，以蘆丁質量（μg）為橫坐標，進行線性回歸。結果如圖3所示，表明蘆丁在0.04～0.20 μg 具有良好線性關系。

圖3 蘆丁對照品標準曲線

2.1.3 不同花期石斛花黃酮含量

由表1可知，鐵皮石斛花微花期中總黃酮含量比盛花期總黃酮含量高。

表1 不同花期石斛花黃酮含量

2.2 羥自由基清除力分析

由圖4可知，微花期和盛花期石斛花試樣的羥自由基清除能力均隨濃度增加而增強，且微花期羥自由基清除能力與對照樣品相當，比盛花期強。

圖4 樣品羥自由基清除力

2.3 超氧陰離子清除力分析

由圖5可知，微花期和盛花期石斛花試樣的超氧陰離子清除能力均隨樣品的濃度增加而增強，且微花期羥自由基清除能力與對照樣品相當，比盛花期強。

圖5 樣品超氧陰離子清除力

3 結論

本文通過高效液相色譜法對不同花期鐵皮石斛花中總黃酮含量進行測定分析。實驗結果顯示，微花期鐵皮石斛的黃酮含量比盛花期鐵皮石斛黃酮含量高；同時通過羥自由基和超氧陰離子清除力實驗驗證了石斛花具有一定的抗氧化能力，且微花期石斛花的抗氧化能力比盛花期強，為合理利用富余的鐵皮石斛花資源提供了理論參考依據。