菌落總數(shù)測(cè)試片定量檢測(cè)的方法驗(yàn)證

蘇妙儀，嚴(yán)家俊，張 娟

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山 528300）

微生物檢驗(yàn)是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定食品食用安全性的科學(xué)依據(jù)之一。我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌3 項(xiàng)。菌落總數(shù)是指食品樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1.0 g 或1.0 mL 檢測(cè)樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)[1]。菌落總數(shù)是判定食品是否安全的重要指標(biāo)之一[2]。微生物快速測(cè)試片法是直接將食品樣液接種后于一定溫度下培養(yǎng)，最終觀察并計(jì)數(shù)的一種測(cè)定樣品中微生物指標(biāo)的方法[3]。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）相比，菌落總數(shù)定量測(cè)試片法無需配制培養(yǎng)基[4-5]，可有效降低實(shí)驗(yàn)誤差[6]，操作簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)時(shí)間短，適合戶外操作，或?qū)⒓{入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

目前，快速定量測(cè)試片主要分為濾紙、無紡布和冷水溶性凝膠3 種類型[7]。其中濾紙和無紡布雖然成本低廉，但保水性差，孔隙大，且菌落顯色不清晰，給菌落計(jì)數(shù)增加難度[8-9]。而冷水可溶性凝膠透明、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、回收率高，易挑菌，更適用于微生物快速檢測(cè)[10-11]。吳許文等[12]研究發(fā)現(xiàn)，冷水可凝凝膠測(cè)試片適合用于食品菌落總數(shù)檢測(cè)，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法結(jié)果無顯著性差異。

本研究選擇大腸埃希氏菌為測(cè)定菌，所使用的菌落總數(shù)定量測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基產(chǎn)品，含標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂、吸水凝膠和脫氫酶指示劑氯化三苯基四氮唑（TTC）。TTC 是一種氧化還原指示劑，水溶液無顏色。細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將無色的TTC 還原為紅色的三苯甲臢，使菌落變成紅色，通過紅色菌點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判定[13-14]。在6 類不同食品中進(jìn)行加標(biāo)，對(duì)比菌落總數(shù)定量測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果，評(píng)價(jià)其測(cè)定的準(zhǔn)確性和應(yīng)用可行性，為研發(fā)適用于食品的新型快速微生物定量檢測(cè)方法提供實(shí)踐參考。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備

HVA-85 高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA 公司；1300 SERIES A2 生物安全柜；DiluFlow 全自動(dòng)電子稀釋儀；Bagmixer 400SW 拍打式均質(zhì)器；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 材料與試劑

奶及奶制品、飲料、冷凍食品、肉制品、方便食品和寵物食品：客戶送樣；平板計(jì)數(shù)瓊脂：北京陸橋檢測(cè)技術(shù)有限公司；菌落總數(shù)定量測(cè)試片：某品牌有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）：廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

選取6 種食品類別，每個(gè)類別選取5 種樣品。分別取25 g（mL）樣品于裝有225 mL 滅菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，用均質(zhì)機(jī)混勻，配制成1∶10 的樣品液，每個(gè)樣品制備3 份同樣的樣品液。取1 mL 0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊拇竽c埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌液加入上述1 份樣品勻液中混勻，靜置30 min 后，得到高濃度污染樣品。再分別稀釋100 倍和1 000 倍加入樣品中，制備中濃度和低濃度污染樣品。

1.4.2 樣品接種

依據(jù)GB 4789.2—2016 的方法，選擇2～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別吸取1 mL 樣品液接種于菌落總數(shù)測(cè)試片及國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法平皿中，每梯度進(jìn)行5 個(gè)重復(fù)。

1.4.3 培養(yǎng)與結(jié)果觀察

菌落總數(shù)測(cè)試片置于（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，選取菌落數(shù)30～300 CFU 的定量測(cè)試片進(jìn)行結(jié)果判定。平皿按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察結(jié)果。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片和國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法測(cè)得的菌落總數(shù)結(jié)果的符合率、相關(guān)性和差異性進(jìn)行匯總分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用EXCEL 軟件和SPSS19.0 軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落測(cè)試片與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較

將30 份樣品分別經(jīng)過高、中、低濃度污染后進(jìn)行接種，計(jì)算生長(zhǎng)率PR，并分析符合率[15]。菌落總數(shù)定量測(cè)試片方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法結(jié)果的生長(zhǎng)率均≥0.7（圖1），符合率達(dá)100%，可認(rèn)為兩種方法檢測(cè)結(jié)果是一致的，菌落總數(shù)定量測(cè)試片方法能滿足食品樣品的檢測(cè)需求。

此外，菌落總數(shù)定量測(cè)試片在不同種類食品中檢測(cè)效果也有所不同。由圖1可知，奶制品與寵物食品在高、中、低不同濃度大腸埃希氏菌污染下檢測(cè)的菌落總數(shù)生長(zhǎng)率接近，且在中和低污染濃度下檢測(cè)結(jié)果更趨向于1.0；肉制品在低的污染濃度下生長(zhǎng)率趨向于1.0，中、高濃度時(shí)兩種檢測(cè)結(jié)果基本一致；飲料、冷凍食品和方便食品在3 個(gè)污染濃度下檢測(cè)的生長(zhǎng)率在1.0～1.2。總體而言，在6 類食品的測(cè)試中，菌落總數(shù)定量測(cè)試片方法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法測(cè)定效果有較好的一致性。此外，不同基質(zhì)樣品在菌落總數(shù)定量測(cè)試片均長(zhǎng)出鮮紅色菌點(diǎn)，清晰可見，有利于菌落區(qū)分，計(jì)數(shù)時(shí)長(zhǎng)可縮短1/2，有效提高工作效率。

圖1 菌落總數(shù)測(cè)試片法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法生長(zhǎng)率比較(n=5)

2.2 菌落總數(shù)定量測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的相關(guān)性分析

根據(jù)樣品接種試驗(yàn)結(jié)果，以菌落測(cè)試片結(jié)果對(duì)數(shù)值log(CFU·g-1)為橫軸（x），以國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)數(shù)值log(CFU·g-1)為縱軸（y），分別繪制不同類別食品樣品的擬合曲線。6 類樣品的回歸方程和決定系數(shù)分別如圖2所示，R2均大于0.999 0，不同類型樣品菌落測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果均為強(qiáng)相關(guān)，即兩種方法的變化趨勢(shì)非常一致。

圖2 菌落總數(shù)測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系

2.3 菌落總數(shù)定量測(cè)試片與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的差異性分析

使用SPSS 軟件，采用單因素方差分析菌落測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)法的差異性。如表1所示，不同類型樣品的F值均小于Fcrit，且P＞0.05，說明菌落測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，兩者檢測(cè)結(jié)果基本一致。

表1 菌落總數(shù)測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法差異性分析(n=5)

3 結(jié)論

本研究通過比較菌落總數(shù)測(cè)試片法與GB 4789.2—2016 對(duì)6 種不同類別食品菌落總數(shù)的檢測(cè)，探索測(cè)試片法在快速檢測(cè)食品中菌落總數(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用可行性。結(jié)果表明，采用菌落測(cè)試片法具有快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果便于判定等優(yōu)點(diǎn)；在菌落計(jì)數(shù)方面，時(shí)長(zhǎng)可縮短一半，能夠有效提高工作效率。與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異。在實(shí)際檢測(cè)工作中，可根據(jù)檢測(cè)環(huán)境、設(shè)備配置情況及樣品的特性選擇合適的方法，既可提高檢測(cè)效率，又可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。