醫(yī)學生學習透射電子顯微鏡生物制樣技術(shù)必要性研究

摘 "要 "透射電子顯微鏡是醫(yī)學院校利用率較高的大型儀器設(shè)備之一，由于設(shè)備昂貴、對制樣技術(shù)要求較高等原因，現(xiàn)主要被用于科研工作。為提高醫(yī)學生的專業(yè)素養(yǎng)和科研能力，在對外開放實驗教學中開展透射電子顯微鏡生物制樣技術(shù)的學習，通過課堂示教、集體觀摩等方式，讓學生掌握生物制樣過程、制樣要點、在實際工作中的意義等，為醫(yī)學生步入臨床和科研工作打下基礎(chǔ)，也為大型儀器設(shè)備進入醫(yī)學生實驗教學提供經(jīng)驗交流。

關(guān)鍵詞 "醫(yī)學生；透射電子顯微鏡；透射電鏡生物制樣技術(shù)；實驗教學

中圖分類號：G642.423 " 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2022）13-0143-03

0 "引言

隨著我國高等教育的持續(xù)發(fā)展和科技水平的不斷提升，越來越多的大型精密儀器被投入高校和科研院所，其中透射電子顯微鏡在醫(yī)學、材料科學、化工、紡織、物理、生命科學等學科領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。透射電子顯微鏡簡稱透射電鏡，是人們探究微觀世界的大型儀器之一。

1 "我國電子顯微鏡的發(fā)展

我國電子顯微鏡的研制開始于20世紀50年代，第一臺中型透射電鏡于1958年由中國科學院長春光學精密機械與物理研究所研制成功，分辨率為10 nm，加速電壓50 kV，是當時我國的重大科技成果。1959年，大型透射電鏡研制成功，性能進一步提高，放大倍數(shù)10萬倍，加速電壓達到100 kV，分辨率

2.5 nm。1980年研制的DX-4透射電鏡，分辨率已達到0.3 nm，放大倍率為60萬倍[1-2]。隨著技術(shù)水平的不斷提高，現(xiàn)在的透射電鏡分辨率已達0.1～

0.3 nm，最大放大倍率達到150萬倍以上。目前電鏡的種類，除了常見的透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）外，還有超高壓電鏡（UVEM）、反射式電鏡（REM）和分析電鏡（AEM）等。電鏡迅速發(fā)展的同時，電鏡技術(shù)也得到不斷發(fā)展，在常規(guī)超薄切片技術(shù)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)冷凍復(fù)型技術(shù)、電鏡細胞化學技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、負染色技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、冷凍制樣技術(shù)[3]等，由此也推動多學科發(fā)展。

2 "透射電鏡生物制樣技術(shù)實驗教學內(nèi)容

通過學院教務(wù)系統(tǒng)申報透射電鏡生物制樣技術(shù)實驗教學的上課時間和學生數(shù)（為保證實驗教學質(zhì)量，限制20人之內(nèi)），由學生自愿申報，學生負責人聯(lián)系教師，報告具體人數(shù)和學生名單。授課教師帶領(lǐng)學生參觀透射電鏡實驗室，向?qū)W生介紹透射電鏡的發(fā)展現(xiàn)狀、設(shè)備構(gòu)造、工作原理、主要參數(shù)以及應(yīng)用領(lǐng)域等相關(guān)理論知識，介紹生物制樣技術(shù)在科研工作中發(fā)揮的作用以及在臨床中對疾病診斷、鑒別診斷的意義；列舉科研工作中的制樣經(jīng)驗，引入一些經(jīng)典的透射電鏡照片，使講解更生動。在學習生物制樣技術(shù)前，把包埋模具、銅網(wǎng)、鉆石刀、重金屬染色劑（鈾和鉛）等制樣工具和試劑介紹給學生，使學習內(nèi)容由淺入深。透射電鏡生物制樣技術(shù)包括取材、固定、梯度脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切片和染色等步驟，由于操作過程煩瑣和制樣時間所限（通常7～10天完成），制樣過程由教師分步驟示教講解操作要點。制作透射電鏡超薄切片需要注意以下幾點。

1）取材遵循五字原則，即快、小、冷、凈、準。快：組織離體后盡快進入固定液，避免細胞內(nèi)溶酶體膜破裂，組織自溶。小：2.5%戊二醛固定液滲透速率較慢（僅為0.5 mm/h）[4]，為使固定液迅速浸入細胞和組織間隙，組織標本的取材大小應(yīng)為

1 mm3。冷：取材過程在冰盒上進行，冷的環(huán)境可以降低各種酶的活性，使超微結(jié)構(gòu)保持原有狀態(tài)。凈：用緩沖液沖洗組織標本表面，避免殘留血液、黏液等，影響實驗結(jié)果。準：取材的位置要求定位和定向準確，避免重切重染增加工作量，對于珍貴的組織標本，無法重現(xiàn)相同結(jié)構(gòu)，將造成重大損失。注意某些組織具有方向性，比如腸道、皮膚、氣管、血管、神經(jīng)、眼組織等，取材時注意區(qū)分。

2）特殊組織固定需要注意：腦對缺氧較敏感，需要先灌流固定再取材；管狀組織取0.5 cm左右長軸方向固定；肺組織密度小，用紗布包裹后放入固定液即可下沉；視網(wǎng)膜易脫離、皺褶，應(yīng)先灌流固定，再剪開角膜注入固定液[5]；睪丸白膜下面是精曲小管，常規(guī)取材易散開，應(yīng)在白膜上面劃若干小口，固定一段時間后再取材；細菌和細胞取材3×106～5×106即可，吸管吹散使充分接觸固定液，自然沉降切勿離心。

3）前固定是2.5%戊二醛，固定時間至少四小時；經(jīng)過充分浸洗，浸入后固定液1%鋨酸中，后固定時間因不同組織而異，一般不超過兩小時。

4）梯度脫水時間要充分，組織在包埋劑中浸透最好過夜。

5）獲得連續(xù)切片的關(guān)鍵之一是修塊，使包埋塊切面成正方形、長方形或者梯形，且邊角銳利。

6）超薄切片厚度60～90 nm為宜，此厚度在切片機鏡下呈銀鏡樣反射。鉆石刀價格昂貴，應(yīng)在熟練操作玻璃刀的基礎(chǔ)上謹慎對刀，防止碰撞。

7）染色是重點環(huán)節(jié)，鈾染液需靜置取上清，鉛染液要過濾，整個染色過程要避光，減少暴露空氣的機會，避免出現(xiàn)染色液污染。組織超薄切片制作完成，由指導(dǎo)教師開機上樣，學生實地觀摩學習，結(jié)合透射電鏡下組織超微結(jié)構(gòu)圖像，教師邊講解邊提問，既學習新知識，又回顧書本上的內(nèi)容，引導(dǎo)學生不斷探索生命的奧秘。

3 "醫(yī)學生學習透射電鏡生物制樣技術(shù)的必

要性

3.1 "學習透射電鏡生物制樣技術(shù)課的思路

透射電鏡為大型精密儀器，價格昂貴，操作復(fù)雜，導(dǎo)致多數(shù)高校只將其用于科研工作，極少在實驗教學中面向?qū)W生開放，學生對其知之甚少，或者只在書本上有大概了解，沒有實踐學習的機會。為使其能在高校科研和教學中發(fā)揮作用，體現(xiàn)價值[6]，學校建立對外開放實驗教學平臺。學生通過書本上透射電鏡生物制樣技術(shù)的文字和圖片介紹，在頭腦中形成的是抽象的概念，對內(nèi)容的理解也是膚淺的，對生物制樣的過程沒有直觀感受，導(dǎo)致學習的興趣和積極性不高。開設(shè)透射電鏡生物制樣技術(shù)實驗教學，可以通過教師現(xiàn)場講授和學生觀摩學習的方式，拉近學生與設(shè)備的距離，也拉近理論與臨床實踐的距離，使科教臨相互滲透，讓學生對透射電鏡制樣技術(shù)的方法、應(yīng)用和意義等有比較全面的掌握，加深印象，牢記所學知識點。

目前，多數(shù)高校在透射電鏡授課方面對設(shè)備工作原理、構(gòu)造與操作等講授比較多，對制樣技術(shù)沒有提及或涉及較少。由于透射電鏡是形態(tài)學研究的精密儀器之一，對于醫(yī)學生來說，組織結(jié)構(gòu)的觀察辨識是醫(yī)學基礎(chǔ)課，學習生物制樣技術(shù)可讓他們看到光鏡下所看不到的結(jié)構(gòu)，極大地拓寬視野[7]和專業(yè)知識，幫助其掌握制樣過程的細節(jié)和注意事項，不僅知其然，而且知其所以然。對樣品超微結(jié)構(gòu)的觀察和研究，不僅要有分辨率精準的設(shè)備，更要有制備樣品所用的各種技術(shù)方法，兩者相輔相成，缺一不可，為此開設(shè)透射電鏡生物制樣技術(shù)課程。

3.2 "學習透射電鏡生物制樣技術(shù)的意義

通過學習透射電鏡生物制樣技術(shù)，學生不僅可以掌握超薄切片的制備方法，而且可以學習如何從這些超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)組織病理的改變，進而對疾病的鑒別診斷給出正確結(jié)論，從而不斷提升專業(yè)修養(yǎng)，增強為患者服務(wù)的本領(lǐng)。學生可以在計算機上看到組織超微結(jié)構(gòu)圖像，從觀察細胞器開始，培養(yǎng)探索生命和疾病本質(zhì)的興趣，激發(fā)從醫(yī)的信心和立志為患者解除病痛的決心。

學習透射電鏡生物制樣技術(shù)可以強化課堂理論學習，同時使各個相關(guān)學科知識點融會貫通，提高學生學習的積極性，培養(yǎng)其學習熱情。在實際工作中，大部分科研人員和臨床醫(yī)生不能親自完成生物制樣，通常由專業(yè)的實驗技術(shù)人員完成。醫(yī)生的職業(yè)特點要求他們終身學習，掌握全面的醫(yī)學相關(guān)知識。因此，醫(yī)學生開展透射電鏡生物制樣技術(shù)的學習，既可以啟發(fā)興趣、拓展知識面，激發(fā)主動學習的意識，增強救死扶傷的本領(lǐng)，也有助于養(yǎng)成良好的科學研究思維和素養(yǎng)。

透射電鏡生物制樣過程中的每一步驟都需要細致入微，認真對待，任何的失誤都會造成制樣失敗。因此，在實驗教學中應(yīng)注意啟發(fā)學生熱愛醫(yī)學、尊重生命，積極探索微觀世界，樹立嚴謹?shù)目蒲凶黠L和醫(yī)者的責任感。

醫(yī)學生在基礎(chǔ)醫(yī)學學習階段應(yīng)多學習與臨床和科研相關(guān)的實驗技術(shù)，掌握臨床病理診斷和科研工作的前沿技術(shù)方法，為將來進入工作崗位打下堅實基礎(chǔ)。透射電鏡超薄切片也是臨床某些疾病病理診斷的黃金指標，醫(yī)學生能從形態(tài)學角度分析病情，是加強專業(yè)學習的關(guān)鍵。

深入學習透射電鏡生物制樣技術(shù)是醫(yī)學生增強本領(lǐng)的需要，是理論與實踐相結(jié)合的需要，是拓展專業(yè)知識的需要，更是提高臨床技能和科研實驗?zāi)芰Φ男枰Ｒ囵B(yǎng)醫(yī)學生的動手能力、思考能力，提高實驗操作技能，啟發(fā)探索微觀世界的興趣，同時引導(dǎo)他們無論將來從事臨床工作還是科研工作，務(wù)必求真，務(wù)必尊重科學。透射電鏡技術(shù)的進步大大加深人類對生命科學的認識，從宏觀世界到微觀世界，從細胞水平進入分子水平，從分子水平再到原子水平，透射電鏡在醫(yī)學領(lǐng)域發(fā)揮了革命性的作用。讓透射電鏡生物制樣技術(shù)走進醫(yī)學院校課堂是時代所需[8]，是醫(yī)學生扎實學習醫(yī)學基礎(chǔ)知識的需要，是他們提高專業(yè)本領(lǐng)的要求，而掌握透射電鏡生物制樣技術(shù)是醫(yī)者的使命擔當，更是他們的職業(yè)所必須。

3.3 "透射電鏡生物制樣技術(shù)在臨床醫(yī)學中的應(yīng)用

透射電鏡生物制樣技術(shù)在臨床各種疾病的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)測過程中具有重要意義。遺傳性疾病和代謝異常導(dǎo)致的疾病，其光鏡切片并不能在早期觀察到細胞器結(jié)構(gòu)的改變。如先天的肝臟代謝異常，應(yīng)用透射電鏡觀察線粒體在早期的病理變化對診斷有很高價值。有些腎病，比如免疫復(fù)合物性腎炎、膜性腎炎等，光鏡下無明顯結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光有時定位不準或抗體效價降低，只能通過透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)中上皮細胞、系膜、肌膜細胞和間質(zhì)改變，明確腎小球內(nèi)電子致密沉積物的精確定位等來確診[9]。各種早期腫瘤篩查，通過尋找組織細胞的分化標記，確診和鑒別腫瘤類型。如急性髓系白血病的診斷分型，通過透射電鏡觀察細胞核和線粒體的結(jié)構(gòu)、形態(tài)變化，可以提高鑒別能力，分型效果具有明顯優(yōu)勢[10]。病毒性疾病的鑒別診斷，常用透射電鏡負染技術(shù)，負染色的特點是反差強，可以看到病毒亞單位結(jié)構(gòu)、細菌和支原體的超微結(jié)構(gòu)等，它也是病毒性致病因子的快速診斷方法之一[11]，能夠發(fā)現(xiàn)和識別病毒，為病毒的分類、病毒復(fù)制過程、病毒與宿主之間的關(guān)系等提供直觀圖像依據(jù)。

透射電鏡技術(shù)與免疫學技術(shù)相結(jié)合形成免疫電鏡技術(shù)，通過標記物可以精確定位和檢測細胞表面和細胞內(nèi)部的抗原、抗體。有些腎病單靠透射電鏡不能確診，比如lg A腎病合并膜性腎炎，用膠體金標記特異性抗體lg A和lg G，通過觀察腎小球上皮下和系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積分布情況和電子致密物的成分，確定腎病的分型[12]。

透射電鏡生物制樣技術(shù)的不斷發(fā)展，使其被廣泛應(yīng)用到臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學的各個方面，為醫(yī)學基礎(chǔ)研究提供更多的研究手段，為疾病診斷提供可靠依據(jù)。

4 "結(jié)束語

醫(yī)學生通過透射電鏡生物制樣技術(shù)的學習，認識到制樣技術(shù)的重要性：在臨床上是發(fā)現(xiàn)和診斷某些疾病的重要手段，在科研中是認識物質(zhì)世界的重要工具，是發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的基本方法。制樣技術(shù)是動手性極強的形態(tài)學研究手段，能開闊學生專業(yè)知識視野，同時幫助學生養(yǎng)成認真細致和尊重客觀事實的工作態(tài)度。由于受制樣時間、課時和所用試劑稀缺等因素影響，目前透射電鏡生物制樣技術(shù)課程內(nèi)容還不能完全在臨床醫(yī)學的各個專業(yè)開設(shè)，學生無法親自完成制樣。隨著計算機的發(fā)展，期待未來可以有透射電鏡生物制樣技術(shù)的虛擬仿真系統(tǒng)，使生物制樣過程變得生動形象，同時能對學生制樣的效果進行評價和打分，徹底解決生物制樣實驗教學中學生只看不做的問題。

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