轉化生長因子β1 在血小板促進甲狀腺未分化癌侵襲遷移中的作用

蔣玉娥 ，鐘兆銘 ，高艷章 ，王 偉 ，孫瑞梅 ，孫傳政

（1）昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院檢驗科;2）頭頸外二科，昆明 云南 650118;3）昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，昆明 云南 650032）

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）高度惡性，發病率占全部甲狀腺癌的1%～3%，但其致死率卻占全部甲狀腺癌的35%～50%，研究發現ATC 高死亡率與確診時近50%的遠處轉移發生率關系密切[1-2]，因此，探究ATC 高侵襲轉移的機制，為ATC 的靶向治療提供更多新方案尤為關鍵。早在19 世紀臨床專家就發現，腫瘤患者血小板（platelet，PLT）增多與腫瘤轉移有關[3-4]。最近一項包含17 285 例患者、中位隨訪超過5 a 的臨床研究發現，每日服用阿司匹林（抗PLT 聚集藥物）的患者其腫瘤遠處轉移發生率顯著降低[5]；筆者前期臨床回顧性研究也發現，一些ATC 患者外周血血小板計數增多與其更差的預后密切相關[1]，本研究擬利用人ATC 細胞為研究對象，探索PLT 促進ATC 細胞遷移及侵襲能力的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株實驗所用ATC 細胞系（ARO、FRO、SW579）來自美國模式培養物集存庫（ATCC），昆明醫科大學第三附屬醫院腫瘤研究所有凍存品備用。所有細胞系均在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養，ARO 和FRO 細胞系在含5%胎牛血清（FBS）的1640 培養基中培養，SW579 在含10% FBS 的DMEM 培養基中培養。

1.1.2 主要試劑及來源抗體（fibronectin、snail、a-catenin、GAPDH）購于Cell signal technology，Ecadherin 抗體購于 Abcam 公司，細胞因 子TGFβ1 購于Peprotech 公司。PCR 引物購于生工生物，PCR 的mix 購于Invitrogen 公司。使用的qPCR 設備來自羅氏公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PLT 提取抽取健康志愿者外周靜脈血5 mL 于抗凝管中（包括ACD 液），靜置30 min，室溫200 g 離心20 min，上清液即為富含PLT 的血漿。吸出上清置于EP 管中，室溫800 g 離心20 min，棄上清管底沉淀為PLT。輕輕沿管壁加入PLT 洗滌液1 mL，重復1 次。Tyrode 緩沖液（包括5 mM 葡萄糖和新鮮3% BSA）重懸PLT。提取的PLT 盡快用于實驗以防其失活。將PLT 與ATC 細胞按照10∶1 的比例加入無血清培養基中進行共培養。

1.2.2 劃痕實驗單細胞層、低血清（1%胎牛血清）體系培養。一次性10 μL Tip 頭尖端在培養皿中劃3～5 道平行線，于0、6、12、24 h 隨機取5 個不同視野觀察劃痕愈合并照相。

1.2.3 Transwell 遷移實驗將8 μm 孔徑的小室放入24 孔板中，ATC 細胞加入上層腔室（無血清培養基），下層為含10%胎牛血清培養基。10 h后取出培養小室，PBS 洗滌小室預冷甲醇固定細胞20 min 后，小心用棉簽擦拭去除室內貼附細胞，0.5%結晶紫室溫染色5 min 計數。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）首先包被抗體4 ℃孵育過夜，然后加入100 μL 待測細胞培養上清進行孵育，室溫2 h。隨后加入TGFβ1 檢測抗體進行孵育，室溫2 h。緊接著加入100 μL辣根過氧化物酶（HRP）標記溶液進行孵育，室溫避光20 min。再加入100 μL 底物液進行孵育，室溫避光20 min，孵育結束后加入50 μL 終止液。將孔板放入酶標儀中，波長設置為450 nm 和570 nm，測定完畢后保存光密度值（OD 值）。縱坐標為OD 值，橫坐標為濃度進行作圖，計算相應樣品的濃度。

1.2.5 實時定量熒光聚合酶鏈反應（Real-time PCR）用TRIZOL 法抽提ATC 細胞總RNA，逆轉錄合成為cDNA，設計合成磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）及TGFβ1 引物，△Ct 法計算目的基因表達差異。Real-time PCR 體系（共10 μL）組成：1 μL cDNA、1 μL 2.5 μmol 上下游引物、3 μL ddH2O、5 μL SYBR qPCR SuperMix。引物序 列：GAPDH Sense 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCA GC-3′，Anti-sense 5′-CCCAATACGACCAAA TCCGTT-3′；TGFβ1 Sense 5′-GGCCAGATCCT GTCCAAGC-3′，Anti-sense 5′-GTGGGTTTCC ACCATTAGCAC-3′配置完畢后即可上機，按說明書步驟設置程序：95 ℃預變性5 min 95 ℃變性15 s；60 ℃退火與延伸 30 s；95 ℃ 15 s；60 ℃1 min；95 ℃ 3 min.結果判定：目的基因的相對表達量（relative expression）=2-△Ct。△Ct=目的基因Ct 值的均數-內參基因的Ct 值。

1.2.6 蛋白質免疫印跡雜交（Western blot）首先提取總蛋白，用BCA 蛋白質測定法檢測蛋白質濃度。隨后配置9%的 SDS-PAGE 凝膠，將蛋白樣品按照每孔30 μg 進行上樣，電泳完畢后進行轉膜，用250 mA 電流于冰上轉膜2.5 h。用5%脫脂牛奶進行封閉，室溫1 h，封閉完成后1×TBST 洗3 次，每次洗5 min，然后孵育一抗[fibronectin（1∶1 000）、snail（1∶1 000）、a-catenin（1∶2 000）、GAPDH（1∶4 000）、E-cadherin（1∶1 000）]，4 ℃過夜，一抗孵育完畢后用1×TBST洗3 次，每次洗10 min，然后孵育二抗，室溫1 h，二抗孵育完畢后用1×TBST 洗3 次，每次洗10 min。最后，用化學發光底物試劑盒（ECL）進行發光成像。Image J 軟件進行灰度分析。

1.3 統計學處理

SPSS 19.0 軟件包統計分析實驗數據。均值比較采用t檢驗，P＜ 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLT 誘導ATC 細胞發生EMT

為了研究PLT 對ATC 細胞形態變化及功能的影響，用從健康人外周靜脈血提取的PLT 與ATC細胞（FRO、SW579）共培養48 h，加入10 倍數量的PLT 后，在顯微鏡下觀察ATC 細胞的形態，結果發現ATC 細胞發生了EMT 樣變化，見圖1A。進一步通過Western Blot 實驗檢測EMT 相關蛋白的表達，發現PLT 可誘導ATC 細胞表達更多的間葉標記蛋白（fibronectin 和snail），證實PLT 可誘導ATC 細胞發生EMT。

圖1 PLT 誘導ATC 細胞發生EMTFig. 1 Platelets induce epithelial mesenchymal transition in ATC cells

2.2 與ATC 細胞共培養促進PLT 分泌TGFβ1

將PLT 與ATC 細 胞（ARO、FRO 或SW579）共培養36 h，Real-time PCR 檢測共培養液中TGFβ1 mRNA 未見顯著增高（ARO 細胞甚至降低）（P＜ 0.01），而Elisa 檢測發 現共培 養液中TGFβ1 蛋白水平顯著升高（P＜ 0.001）（FRO 細胞最顯著），提示TGFβ1 蛋白可能主要來源于PLT釋放，而非PLT 合成，見圖2。

圖2 PLT 與ATC 細胞共培養后TGFβ1 的表達情況Fig. 2 Expression of TGFβ1 after co-culture PLT and ATC cells

2.3 TGFβ1 促進ATC 細胞的遷移能力

為探索TGFβ1 對ATC 細胞的影響，將SW579 細胞與PLT 共培養8 h，或在ATC 細胞中直接加入rhTGFβ1（1 ng/mL）8 h 后，Transwell 遷移實驗顯示，PLT 或rhTGFβ1 可使穿過小室的ATC 細胞顯 著增加（P＜ 0.001），提 示PLT 或rhTGFβ1 能顯著增強SW579 細胞的遷移能力（P＜ 0.001），見圖3A。同樣，劃痕實驗也證實rhTGFβ1 可顯著增強SW579 細胞的遷移能力（P＜ 0.01），見圖3B。

圖3 rhTGFβ1 促進SW579 細胞遷移能力增強Fig. 3 rhTGFβ1 promotes the migratory ability of SW579 cells

2.4 PLT 通過TGFβ1 促進ATC 細胞發生EMT

用PLT 或rhTGFβ1 處理SW579 細胞發現，間葉標記物fibronectin 增高而上皮標記物αcatenin 下降，見圖4A，提示PLT 可能通過分泌TGFβ1 促進ATC 細胞發生EMT；為了檢測PLT是否分泌其他常見細胞因子促進EMT 發生，用CSF1、IL-11 和TGFβ1 分別處理ARO 細胞發現，只有TGFβ1 誘導間葉標記物fibronectin 上調和上皮標記物E-cadherin 下調，見圖4B，提示PLT 可能通過釋放TGFβ1 誘導ATC 細胞發生EMT 最終促進其遷移能力。

圖4 PLT 通過TGF β1 促進ATC 細胞發生EMTFig. 4 Platelets promote epithelial-mesenchymal transition in ATC cells through TGFβ1

3 討論

ATC 惡性程度極高，近年來，盡管手術設備和技巧不斷提高，放療設備、方案不斷創新，化療聯用方案、靶向治療及免疫治療不斷推陳出新，但ATC 確診后中位生存期一直在3～9 個月，1 a生存率不足20%；其高度惡性和極差的預后與其高侵襲轉移能力密切相關[1-2]。另一方面，惡性腫瘤患者常出現特魯索綜合征，即腫瘤患者血栓形成增多和血液呈高凝的狀態[6]。歷史和最近的研究不斷表明，PLT 增多與神經系統腫瘤、呼吸系統腫瘤、消化系統腫瘤以及婦科腫瘤患者更差的預后密切相關[3,4,6-8]。筆者在前期臨床研究也發現，ATC 患者外周血PLT 增多與臨床更差的預后相關[1]，提示PLT 可能會促進ATC 細胞的轉移潛力，然而其機制遠不清楚。

在其他的實體腫瘤中研究發現，PLT 可通過多種機制促進腫瘤的侵襲與轉移。比如，腫瘤細胞進入外周血后可誘導PLT 聚集并包裹腫瘤細胞，使循環腫瘤細胞免受NK 細胞和TNFα 誘導的細胞死亡；進一步的分子水平研究發現，腫瘤細胞可通過粘附分子p-選擇素、GPIIb-IIIa（αIIbβ3整合素）以及C 型凝集素樣受體（CLEC）-2 與腫瘤細胞來源的Podoplanin（平足蛋白）相互作用活化PLT，導致PLT 顆粒釋放高濃度細胞因子，如ATP、PDGF、TGFβ1，協助腫瘤細胞粘附和外滲，最終促進腫瘤轉移[3,7,9-12]；類似研究也證實，阻斷TGFβ1 或其受體顯著降低乳腺癌肺轉移[13-15]，提示TGFβ1 可能與PLT 促進惡性腫瘤進展密切相關。為探索TGFβ1 是否在PLT 促進ATC 惡性進展中發揮作用，采用PLT 與ATC 細胞共培 養36 h，Real-time PCR 檢 測TGFβ1 mRNA 未見顯著增高，而Elisa 檢測TGFβ1 蛋白水平顯著升高，同時還發現TGFβ1、PLT 顯著增強ATC 的遷移能力（圖2、圖3），因此筆者推測PLT 可能通過釋放TGFβ1 最終促進ATC 的遷移和侵襲能力。

用PLT 處理ATC 細胞后采用Western blot 實驗測定EMT 相關標記物發現，間葉標記物（fibronectin、snail）增高，提示PLT 可能誘導ATC細胞EMT 發生；同樣采用TGFβ1 刺激SW579細胞發現，上皮標記物α-catenin 表達下降而間葉標記物fibronectin 增高。為檢測PLT 是否也通過其常分泌的細胞因子促進ATC 細胞發生EMT，用CSF1、IL-11 處理ARO 細胞發現，二者均不能誘導上皮標記物E-cadherin 下調和間葉標記物fibronectin 上調，同時ATC 細胞經與PLT 共培養48 h 后，ATC 細胞形態朝間葉組織方向轉化。所以，筆者認為ATC 細胞通過刺激PLT 釋放TGFβ1，后者誘導ATC 細胞發生EMT 進而促進其侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究提示，PLT 活化后可通過分泌TGFβ1 促進ATC 細胞發生EMT 進而促進ATC 細胞侵襲和遷移能力，提示TGFβ1 可能成為ATC 患者靶向治療的潛在靶點，但上述研究結果仍需要包括體內實驗在內的進一步證實。