miR-582-5p 調控Notch1 減輕心肌缺血再灌注損傷的研究

王 峰 ，楊 偉 ，錢佃倫 ，梅 松 ，王文杰 ，馮科翔 ，白向鋒

（1）昆明醫科大學實驗動物學部，云南 昆明 650500;2）昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科;3）心臟外科，云南 昆明 650032）

急性的心肌梗死是一種危害人類健康的缺血性心肌疾病，急性心肌梗死是由冠狀動脈的缺血和缺氧造成的，可導致心力衰竭、猝死等其他不良癥狀[1-2]。如今臨床上多使用再灌注治療的方法，因為其能促進血流迅速回流到心肌缺血區[3]，雖然再灌注可以改善心肌功能，限制梗塞范圍，很大程度的降低了死亡率，但是再灌注會對心肌帶來其他的損傷，目前心肌缺血再灌注損傷的主要特征為心肌細胞死亡、微血管破壞及炎癥等[4]，此外還會導致心律失常和心肌梗死[5]。就目前針對心肌缺血再灌注損傷的有效干預方式很少，且治療方法效果甚微，因此急需探討心肌缺血再灌注損傷后病理過程中的分子機制，從而為臨床治療找到新的方向和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物、分組及細胞10 只SPF 級雌性C57小鼠（體重18～22 g）購買于昆明醫科大學實驗動物學部，所有實驗方法和操作都得到昆明醫科大學動物倫理委員會的批準（kmmu20220575）。實驗小鼠可以自由的選擇食物和水，同時通風良好，將10 只小鼠隨機性分為2 組，分別為假手術組和心肌缺血再灌注組，假手術組為打開胸腔不結扎左冠狀動脈，心肌缺血再灌注組為打開胸腔用6-0 縫合線結扎冠狀動脈制造心肌缺血再灌注模型。小鼠心肌細胞（HL-1）購買于賽百慷生物技術股份有限公司（上海）。

1.1.2 實驗試劑CCK-8 細胞活力檢測試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司（Biosharp），胎牛血清（FBS）和高糖基礎培養基（DMEM/High Glucose 1X）購自以色列生物科技公司（BI），雙抗（PS）和0.25%胰蛋白酶（TP）購自賽默飛世爾科技公司（Gibco），無水乙醇、氯仿、異丙醇購自天津飛船有限公司，逆轉錄試劑盒（Bester qPCR RT Kit gDNA Remover）和qPCR 擴增試劑盒（Bester Sybr Green qPCR Master Mix）購自上海星漢生物科技有限公司（DBI），Notch1 和β-actin 抗體購自萬類生物。

1.1.3 實驗儀器呼吸機（小動物使用）購自上海贊德醫療器械有限公司，高速低溫離心機、酶標儀和熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司（Bio-Rad），雪花制冰機購自常熟雪科有限公司，超凈工作臺購自蘇州馮氏有限公司，細胞恒溫培養箱購自賽默飛世爾科技公司（Thermo）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HL-1 細胞培養HL-1 細胞放置于25 cm3的細胞培養瓶中培養，在配置好的 89% DMEM 高糖、10% FBS 和 1% PS（雙抗）的完全培養基中生長，將HL-1 細胞懸液加入到含完全培養基的細胞培養瓶中，并置于37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 OGD 模型構建將原先HL-1 細胞的完全培養基（89% DMEM 高糖+10% FBS+1% PS）更換為DMEM 的無糖培養基并放于恒溫培養箱內以5% O2、95%N2的條件進行培養12 h，而后把DMEM 無糖培養基再更換為原先使用的完全培養基，繼續培養2 h 后收集細胞。

1.2.3 miR-582-5p 的 Mimics 和 Inhibitor 轉染將HL-1 細胞接種至6 孔板中，根據轉染試劑說明 書（ribo FECTTMCP）將miR-582-5p 的Mimics、mimics NC、Inhibitor 和inhibitor NC 轉染至6 孔板中，在37 ℃的細胞培養箱中培養至48 h 收集細胞。

1.2.4 CCK-8 實驗將HL-1 細胞接種到 96 孔板上。根據分組對每孔進行miR-582-5pmimics和Inhibitor 的轉染，保持每孔總體積一樣，轉染48 h 后使用倒置顯微鏡來觀察細胞狀態，隨后用電腦拍照保存。在顯微鏡拍照后，往每孔加入10 μL 的CCK-8 檢測試劑，置于 37 ℃細胞恒溫培養箱中繼續孵育4 h，使用酶標儀檢測450 nm處的OD 值，導出數據分析細胞活力。

1.2.5 MIR 小鼠模型構建在手術開始前對手術室進行紫外線殺菌30 min 以上，整個手術過程保持在無菌環境下。10 只SPF 級小鼠在術前均禁食24 h，給予正常的飲水，在手術前對隨機分組的小鼠進行稱重、編號和標記。模型制作參考董鑫法[6]，使用0.5%戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉（濃度為50 mg/kg），將呼吸機和心電圖機與小鼠連接上，使用推子將小鼠胸部位毛發剔除，碘伏消毒。從胸部左邊依次打開皮膚、各層肌肉組織，鈍性分離3 和4 肋間的肌肉組織，將心臟充分暴露出來同時打開心包，從左心耳下方位置使用縫合線從冠狀動脈左前降支（left anterior decending branch，LAD）下方穿出，然后收縮手術結，將會看到心臟缺血部位開始發白，此外心電圖上ST段顯著抬高，表明MRI 小鼠模型構建成功。45 min后解除結扎線恢復血供2 h，待心前區重新變為紅色表明再灌注成功。

1.2.6 qPCR 實驗取小鼠的心臟缺血部位和對照組同樣部位心臟組織，用qPCR 方法驗證了miR-582-5p 和Notch1 的表達。從Pubmed 中獲取miR-582-5p、Notch1 及內參U6、GAPDH 的核酸序列，利用Primer Premier 5 軟件設計并合成，具體序列，見表1。對收集的小鼠心臟組織利用Trizol 進行裂解，按照試劑盒說明書Rnaiso plus提取小鼠心臟組織的總RNA。使用酶標儀進行總RNA 濃度和純度的測量，根據試劑說明書Bester qPCR RT Kit gDNA Remover 進行逆轉錄操作，并根據試劑說明書Bester Sybr Green qPCR Master Mix（95 ℃/10 s，58 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共40 次循環）進行熒光定量PCR 反應，最后根據公式2-△△CT來計算相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 實驗加入RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑雞尾酒片混合后，勻漿、超聲提取樣品總蛋白。BCA 法定量蛋白后，加入上樣緩沖液，煮沸變性。取60 μg 總蛋白上樣，PAGE 膠分離后15 V，30 min 將蛋白轉印到PVDF 膜。將PVDF 于5%脫脂牛奶中封閉2 h。棄去牛奶，加入TBST 稀釋好的一抗（Notch1：1∶1 000；βactin：1∶5 000）4 ℃過夜。TBST 漂洗后孵育二抗（goat-anti-rabbit，1∶2 000）室溫輕搖2 h。TBST漂洗后HRP-ECL 法發光，使用Geldoc 凝膠成像分析儀，BIO-RAD 采集圖片，Image J 測量灰度，β-actin 為內參。

1.3 統計學處理

使用IBM SPSS Statistics 21 軟件進行統計處理，2 組之間分析比較使用獨立樣本t檢驗，3 組及以上分析比較使用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MIR 后心肌組織中和OGD 后心肌細胞中miR-582-5p 上調和Notch1 下調

使用qPCR 對miR-582-5p 和Notch1 在心肌缺血再灌注小鼠和HL-1 細胞OGD 模型中的表達量進行檢測，與對照組相比，發現miR-582-5p在小鼠缺血心臟組織和OGD 細胞中都明顯異常升高，見圖1A、圖1B；而Notch1 卻明顯表達下降，見圖1C、圖1D。

圖1 miR-582-5p 和Notch1 在心肌缺血再灌注小鼠心臟組織和HL-1 細胞OGD 模型中的表達Fig. 1 Expression of miR-582-5p and Notch 1 in cardiac tissue and HL-1 cell OGD model of myocardial ischemia-reperfusion mice

2.2 miR-582-5p 可調控Notch1 的表達

通過TargetScan 網站（https://www.targetscan.org/vert_72/）對miR-582-5p 與Notch1 的靶向結合位點進行預測，結果顯示miR-582-5p 與Notch1 可以靶向結合，結合位點共有7 對堿基，見圖2A。在HL-1 細胞中轉染miR-582-5p 的Inhibitor 和Mimics，與NC 組相比，結果表示Inhibitor 能夠顯著降低miR-582-5p 在HL-1 細胞中的表達水平，Mimics 能明顯提高miR-582-5p 在HL-1 細胞中的表達，見圖2B。于是同時用PCR 和WB檢測了Notch1 的表達水平，與NC 組相比，miR-582-5p 的Inhibitor 轉染后，Notch1 的表達明顯上調，Mimics 轉染后，Notch1 的表達卻明顯降低，見圖2C、圖2D 和圖2E，發現無論是在mRNA水平還是蛋白水平，Notch1 都受到了影響。

圖2 miR-582-5p 可靶向Notch1 并調控其表達Fig. 2 miR-582-5p targets Notch 1 and regulates its expression

2.3 上調Notch1 可保護心肌細胞

使用CCK-8 檢測了轉染miR-582-5p 的Inhibitor 和Mimics 后的HL-1 細胞活力，結果顯示與NC 組相比，轉染Inhibitor 后細胞活力明顯升高，此外轉染Mimics 后細胞活力有大幅的下降，見圖3A；同樣在HL-1 細胞OGD 模型后復氧轉染Inhibitor 和Mimics 檢測細胞活力，得到了與其一致的結果，見圖3B。這表明miR-582-5p 被抑制后，Notch1 表達上調后對心肌細胞產生了保護作用。

圖3 HL-1 細胞活力的檢測Fig. 3 Detection of HL-1 cell viability

3 討論

心肌缺血再灌注損傷具有非常復雜的病理生理機制，在心臟病上帶來的負擔由來已久，同樣影響深遠[7]。目前，有許多研究發現在病理損傷、組織損傷或者生理刺激下都存在miRNA 的異常表達[8-9]，越來越多的報道證實miRNA 參與了這些疾病的發生發展[10]，當然在心肌缺血再灌注損傷損傷中miRNA 也發揮了重要的調節作用[11-12]。此外，諸多研究表明miR-582-5p 在腫瘤發生發展[13]、新生兒缺血缺氧性腦病[14]和缺血性腦卒中[15]擔任著重要角色，但是miR-582-5p 在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究卻很少，這就需要去探究其在心肌缺血再灌注中發揮的作用。本研究發現miR-582-5p 在小鼠心肌缺血再灌注損傷后，表達升高，并且在小鼠HL-1 細胞OGD 模型復氧后表達也異常升高。此外，在降低其在HL-1 細胞中的表達后發現，無論是正常HL-1 細胞還是HR 后的HL-1 細胞，細胞活力都明顯提高，這表明其對心肌缺血再灌注損傷有潛在的危害。

Notch1 是異二聚體跨膜受體Notch 家族中的一員，具有調節細胞分化、增殖、凋亡和發育的功能[16-18]。目前，許多研究表明激活Notch1 可以減輕MIR 帶來的氧化應激和自噬等[19-20]，從而改善心肌缺血再灌注損傷并且保護心肌細胞[20]。本研究發現miR-582-5p 可以調控Notch1 的表達，在miR-582-5p 被抑制后，Notch1 的表達顯著升高，有趣的是HL-1 細胞的活力因此明顯提高，這表明Notch1 可以有效的保護心肌細胞從而來對抗缺血缺氧造成的損傷。

本研究初步證實了miR-582-5p 介導Notch1在心肌缺血再灌注損傷中對心肌細胞的保護作用，結果表明miR-582-5p 表達的抑制可以有效的提高心肌細胞的活力，這是通過調控Notch1 來實現的。本研究從microRNA 水平揭示了心肌缺血再灌注損傷的分子機制，找到了其可能調控的下游分子，提示了miR-582-5p 和Notch1 在治療心肌缺血再灌注損傷中的潛在價值。