miR-130b-3p 促進人牙源性iPSCs 重編程的作用

譚小兵 ，張 敏 ，郭 宇 ，杜琳玲 ，戴青原

（1）云南省第一人民醫院口腔醫學中心/昆明理工大學附屬醫院，云南 昆明 650032;2）昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，云南 昆明 650032）

自從誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）產生以來，它在細胞移植治療、藥物篩選和人類疾病模型等方面的應用前景就受到廣泛關注[1-3]。iPSCs 的應用正逐漸走向臨床研究，探索用于各種疾病的細胞治療，如帕金森、黃斑變性、脊髓損傷等[4]。制約其進一步應用的一大瓶頸就是較低的重編程效率[5]，而微小RNA（microRNAs，miRNAs）在體細胞重編程中的調控作用逐漸受到重視[6]。牙源性細胞易于獲取、重編程效率高，采用仙臺病毒誘導可得到安全性能較高的iPSCs，是理想的種子細胞[7]。前期研究[8]分析人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）重編程過程miRNAs 的表達譜，結果發現miR-130b-3p 明顯上調，提示它可能通過調控iPSCs 核心基因在重編程中發揮作用。為明確miR-130b-3p 對人DPSCs 重編程的作用，本研究擬用miR-130b-3p 轉染DPSCs，再用仙臺病毒體系進行誘導，提出如下假說：miR-130b-3p 可以促進DPSCs 的重編程，為進一步探索miR-130b-3p 的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

α-MEM 培養基、胎牛血清、Vitronectin、TriZol 試劑盒、iPS 2.0Sendai reprogramming kit 購自美國Invitrogen；Lipofectamine 3000 試劑購自美國ThermoFisher；PSCeasyII 人多潛能干細胞培養基、PSCeasy 人多潛能干細胞消化液、Repro-Easy 重編程培養基購自北京賽貝生物；一步法RT-PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京）；hsamiR-130b-3p-mimics 質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；倒置相差顯微鏡購自德國Carl Zeiss。

本研究方案得到云南省第一人民醫院醫學倫理委員會的批準同意實施（2018LH051）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人DPSCs 復蘇培養復蘇凍存的DPSCs（第3 代），完全培養液：αMEM+10%胎牛血清 +1% L-谷氨酰胺+1%青/鏈霉素，37 ℃、5%二氧化碳恒溫孵育箱內培養。

1.2.2 miR-130b-3p 轉 染（1）miR-130b-3pmimics 質粒的構建：設計合成LV3-shRNA DNA模板，退火處理，取10 μg LV3 載體進行酶切處理，構建LV3-shRNA 載體、氯化鈣法制備感受態細胞、轉化連接產物、抽取質粒、EcoRI 進行單酶切鑒定，陽性克隆進行測序鑒定，測序正確的菌株進行抽提，所得質粒用于后續實驗；（2）has-miR-130b-3p-mimics 轉染DPSCs：取1 mL DPSCs（濃度1×105/mL）鋪于6 孔培養板，30-50%融合時將7.5 μL Lipofectamine 3000 試劑加入250 μL MEM，同時將2.5 μg 質粒（分組：miR-130b-3p 空載組和過表達組）和10 μL P3000 試劑加入250 μL MEM，各取上述預混液125 μL 混勻，室溫孵育15 min，然后加入細胞，12 h 后換成正常完全培養基，48 h 后顯現較強熒光時收集細胞，RT-qPCR 進行驗證；（3）RT-qPCR 檢測基因表達：RT-qPCR 對照組 為 DPSCs+miR-130b-3p-NC，實驗組為DPSCs+miR-130b-3p-mimics。轉染48 h后加入Trizol 提取總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，設計合 成hsa-miR-130b-3p 引 物（CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU），qPCR 檢 測基因的表達，實驗結果用2^-△△CT法進行分析，U6 作為內 參（F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGCGT）。

1.2.3 2 組DPSCs 的重編程實驗組為miR-130b-3p 轉染DPSCs，對照組為正常DPSCs，嚴格按照重編程試劑盒說明書進行操作，簡述如下：轉染前2 d 將2 組細胞鋪在6 孔板內（1×105/孔）培養，當天（第0 天）培養基內加入70 μL SeV，隔天再加入130 μL 新鮮培養基，第2 天將培養基換為DPSCs 培養基，第3 天將轉染細胞轉移到Vitronectin 覆蓋培養板，加入Repro-easy 培養基，每日換液。克隆出現且大小合適時，將克隆分割為小塊，PSC-easy 培養基（加10 mM Y27632）繼續培養。80%左右融合時，人多潛能干細胞消化液進行傳代，人多潛能干細胞培養基持續培養，每日換液。

1.2.4 2 種DPSCs-iPSCs 的鑒定（1）形態學觀察：2 組iPSCs 克隆形態對比。（2）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）：TriZol 試劑盒提取2 種iPSCs 總RNA，一步法RT-PCR 試劑盒檢測基因的表達。簡述如下：細胞80%融合時，加入適量TriZol 提取細胞總RNA，配制50 μL 反應體系，引物序列，見表1。反應條件：42 ℃ 30 min（逆轉錄）、95 ℃ 3 min（預變性）、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（40 次循環，擴增）、72 ℃ 5 min（補充延伸），反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳，染色成像。

表1 RT-PCR 特異性引物的序列Tab.1 Specific primer sequences of RT-PCR

1.2.5 重編程效率比較比較2 組iPSCs 的重編程效率，計算公式：iPSCs 克隆數/轉染細胞數×100%。

1.3 統計學處理

GraphPad Prism 軟件（8.0）分析數據和制圖，計數資料2 組間比較采用卡方檢驗，計量資料2組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-130b-3p 轉染DPSCs

miR-130b-3p 轉染48h 后可見目標細胞內明顯的熒光染色，見圖1A、圖1B，實驗組miR-130b-3p 的表達水平顯著高于對照組（P＜ 0.01），見圖1C。

圖1 miR-130b-3p-mimics 轉染DPSCs 效率驗證Fig. 1 Validation of DPSCs transfection efficiency by miR-130b-3p-mimics

2.2 2 種iPSCs 形態和標記物表達

2 組iPSCs 均表現為特征性致密的圓形克隆，邊緣清晰、集落內部細胞圓形、形態均一、核質比較大，RT-PCR 結果證實所2 組iPSCs 均可表達干細胞特異標志物Oct4、Nanog，同時外源性病毒SeV 或轉錄因子KOS/Klf4/c-Myc 不再表達，見圖2。

圖2 2 組iPSCs 克隆形態和特異性標記物的表達Fig. 2 Morphology and specific markers expression of iPSCs in two groups

2.3 重編程效率

2 組DPSCs 轉染前約為1×105個細胞，重編程后正常組獲得約18 個ES 樣克隆（效率=0.018%），對照組獲得約37 個克隆（效率=0.037%），高于正常組（檢驗水準α=0.05，P＜0.05）。

3 討論

早期研究發現，miR-130b-3p 通過直接抑制干擾素調節因子1 影響M1 巨噬細胞的極化[9]，也可直接抑制色域解旋酶DNA 結合蛋白9 影響結腸直腸癌細胞的增殖，從而促進腫瘤的發生和進展[10]，但其在體細胞重編程過程中的作用機制尚未報道。本研究所用Lipofectamine 3000 轉染試劑采用脂質納米顆粒技術，尤其是對難以轉染的干細胞可以實現超高的轉染效率，筆者的研究結果也證實這一點。前期生信分析結果提示miR-130b-3p 可能對DPSCs 的重編程有調控作用。為驗證這一假說，筆者首先在人DPSCs 內過表達miR-130b-3p，再用仙臺病毒進行重編程成功得到miR-130b-3p-DPSCs-iPSCs，其克隆形態、特異性干細胞基因表達和外源性基因沉默等特性與正常DPSCs-iPSCs 相同，且具有更高的重編程效率，但克隆的生長速度較為緩慢。Sendai virus 重編程系統是一種RNA 非整合重編程技術，不會結合到宿主細胞染色體或破壞宿主基因，采用單克隆挑選和無飼養層培養技術得到的iPSCs 生物應用的安全性得到提高，本研究結果與Ye[11]和Okumura 等[12]結果一致。

多項研究已發現miRNAs 在體細胞重編程的重要調控作用。Lin 等[13]研究發現miR-302 可以替代傳統轉錄因子OSKM，將人和小鼠體細胞重編程為iPSCs。miR-302 作為基因沉默，同時可下調多個關鍵的表觀調節蛋白，誘導產生全基因組脫甲基化。miR-302 結合AOF2/1 和MECP1/2的基因轉錄產物，形成RNA 誘導、帶有阿爾古蛋白和Dicer 核糖核酸內切酶的沉默復合體以抑制這些關鍵調節蛋白的轉錄。Lin 等[14]進一步研究發現miR-302 靶向沉默AOF2 以破壞DNMT1 活性，抑制iPSCs 復制相關DNA 甲基化，發生被動性去甲基化。從某種意義上說，重編程發生的機制就是全基因組的去甲基化[15]。miR-302 誘發重編程事件的機制可能為：一是抑制4 個表觀調節蛋白KDM1、AOF1、p66/MECP1 和MECP2 的表達；二是作用于TGF-β II 型受體，阻斷TGFβ 信號通路，加速間充質-上皮轉化過程；三是靶向結合BMP 抑制劑TOB2、DAZAP2、SLAIN1，從而激活BMP 信號通路，促進iPSCs 的產生。

其他研究也證實miRNAs 對體細胞重編程的重要調控作用。Miyoshi 等[16]聯合應用miR-200c、miR-302、miR-369（無OSKM 因子），成功將大鼠和人細胞重編程為iPSCs。其他研究也發現更多的與重編程和iPSCs 多能性相關的miRNAs 及其靶基因的相互作用，包括miR-290 簇、miR-let7家族、miR-130/301/721 家族、miR-106b-25/miR-106a-363、miR-181 家族等[17]。最新研究發現miR-27b 可以抑制未分化hiPSCs 的多能性標記物堿性磷酸酶和Nanog 同源異構體的表達和細胞增殖，而過表達miR-27b 可下調BMP 誘導的中胚層標記物，表明miR-27 可以抑制iPSCs 的早期分化[18]。另一項研究通過生物信息學分析、雙熒光素酶報告和基因敲除實驗證實miR-34c 通過靶向c-Myc 可以影響iPSCs 細胞的增殖和多能性[19]。

綜上所述，本研究首次發現miR-130b-3p 過表達可以促進人DPSCs-iPSCs 的生成，同時保持iPSCs 的生物學特性，為人們進一步了解miRNAs調控體細胞重編程的作用機制及干細胞治療提供研究基礎。深入比較2 組iPSCs 在多向分化潛能、核型分析、核心蛋白表達、表觀遺傳特性等方面的差異，同時研究miR-130b-3p 促進人DPSCs重編程生成的作用機制將是筆者下一步的研究內容。