miR-125b-5p 調控HK2 抑制膽囊癌細胞增殖和糖酵解

張 瑋，王保全，雷喜鋒，王 旭，張 梁

（渭南市中心醫院普外科，陜西 渭南 714000）

膽囊癌是常見的膽道惡性腫瘤。由于早期表現為腹痛和不適等非特異性癥狀，患者多于晚期才被確診，錯過了最佳的治療時間，預后較差。據報道，膽囊癌患者的5 a 生存率僅為4.1%[1]。因此，尋找膽囊癌的生物標志物對其臨床診斷和治療十分關鍵。miRNA 是短鏈非編碼RNA，通過與靶基因結合，調節轉錄和轉錄后水平的基因表達，進而參與多種生物過程。例如：過表達miR-1 231 可促進膽囊癌細胞的多西紫杉醇敏感性，減輕膽囊癌的惡性進展[2]。有氧糖酵解是腫瘤的標志，與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關[3]。研究發現，miRNA 與有氧糖酵解密切相關[4-5]。mR-153 通過靶向抑制E3F3 抑制甲狀腺癌的糖酵解[6]。miR-142 可糖酵解，抑制結直腸癌的轉移[7]。miR-125b-5p 被報道在包括乳腺癌[8]、食管鱗狀細胞癌[9]、肝細胞癌[10]在內的多種腫瘤中表達降低。然而，關于miR-125b-5p 在膽囊癌中的研究鮮有報道。因此，本研究將探討miR-125b-5p 調控膽囊癌細胞增殖和糖酵解的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞人永生化膽囊上皮細胞（Human gallbladder epithelial cells，HGBEC，貨號：CL-416h）、人膽囊癌細胞系GBC-SD（貨號：CL-365h）、NOZ（貨號：CL-315h）、HEK-293T（貨號：CL-209h）細胞購自武漢賽奧斯生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑DMEM 培養基（貨號：MED-1001）購自武漢賽奧斯生物科技有限公司。RPMI 1640（貨號：PM150110B）培養基購自武漢Pricella。NC mimic、miR-125b-5p mimic 和miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 和miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 引物序列是由廣州銳博生物科技有限公司合成。兔抗HK2、LDHA、PDK1、GAPDH 抗體以及山羊抗兔二抗購自Abcam。葡萄糖檢測試劑盒（貨號：ml095040）、乳酸含量試劑盒（貨號：ml077360）、ATP 含量試劑盒（貨號：ml092826）購自上海Mlbio。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）、CCK-8 試劑盒（貨號：CA1210）購自北京Solarbio。TRIzol 試劑（貨號：R0016）和RIPA試劑（貨號：P0013C）購自上海Beyotime。雙熒光素酶試劑盒購自美國普洛麥格。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養HGBEC 細胞培養在完全培養基中，GBC-SD 細胞培養在含10%胎牛血清、1%雙抗的RMPI 1 640，NOZ 細胞接種在DMEM 培養基（10%胎牛血清和1%雙抗）中。HEK-293T 細胞培養在含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1%NEAA 和1%雙抗的DMEM 培養基中。將培養基置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中。

1.2.2 細胞轉染取對數生長期的GBC-SD 細胞，根據Lipofectamine 2000 試劑盒說明書，分別將NC mimic、miR-125b-5p mimic 和miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 和miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 轉染至GBC-SD 細胞中。轉染48 h 后，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和Western blot 檢測轉染效率。

1.2.3 RT-qPCRTRIzol 試劑用于提取細胞中的總RNA，通過逆轉錄試劑盒合成cDNA，SYBR?Green PCR Master Mix 用于qPCR 測定。反應條件為：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環。U6 作為miR-125b-5p 的內參，GAPDH作為HK2 的內參。2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達水平。引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Western blot收集各組中的細胞，通過RIPA 緩沖液裂解細胞，BCA 試劑盒測定蛋白質濃度。將蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行分離，隨后將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜上，在5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h。使用稀釋后的一抗（HK2（1∶2 000）、LDHA（1∶2 000）、PDK1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 500））4 ℃過夜孵育，洗滌后加入二抗（1∶5 000）在室溫中孵育1 h。ECL 化學發光試劑顯示蛋白條帶。化學發光信號凝膠成像儀采集圖像，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH 作為實驗內參。

1.2.5 細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）采用CCK-8 試劑盒檢測蛋白質的增殖活力。收集轉染后的各組細胞，以6×103個/孔的密度接種至96 孔板中，在細胞培養箱中培養適當時間（0、24、48、72 h），并在對應時間點向每孔中加入CCK-8 試劑20 μL。孵育2 h 后通過酶標儀檢測450 nm 處吸光度值。

1.2.6 葡萄糖攝取、乳酸生成以及ATP 水平檢測以1×105的密度將細胞接種至12 孔板中，過夜培養后棄去細胞培養基，用PBS 洗滌細胞兩地。將細胞接種至37 ℃含74～148 kBq/mL18FFDG 的葡萄糖細胞培養基中培養1h，PBS 洗滌細胞2 次，并加入0.5 M NaOH 1mL 用于裂解細胞。γ 計數器用于檢測裂解物中的放射性。細胞內18FFDG 攝取標準化為相應細胞數的放射性讀數[11]。

通過乳酸含量試劑盒和ATP 含量試劑盒用于測定乳酸生成量和ATP 的水平。根據試劑盒說明書，收集細胞上清液用于乳酸濃度測定，下層細胞沉淀裂解后用于測量ATP 的含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗將與miR-125b-5p 具有結合序列的野生型HK2 和突變型HK2 克隆到pGL3-control 載體中。將細胞接種至24 孔板中，分別將NC mimic、miR-125b-5pmimic 和HK2-WT 或HK2-MUT 轉染至HEK-293T 細胞中。轉染48 h 后收集細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒通過TD-20/20 發光計檢測雙熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內參。

1.3 統計學處理

所有數據均采用GraphPad Prism 8.0 分析和作圖。數據表示為“均值±標準差”（）。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。所有實驗均進行3 次重復。P＜ 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-125b-5p 在膽囊癌組織和細胞中表達降低

收集人膽囊上皮細胞HGBEC 和膽囊癌細胞GBC-SD、NOZ，分別提取RNA，通過RT-qPCR測定miR-125b-5p 的表達，發現miR-125b-5p在GBC-SD 和NOZ 細胞中表達低于HGBEC 細胞（P＜ 0.000 1），見圖1A，且在GBC-SD 細胞中表達更低。進一步通過TCGA 數據庫預測發現，miR-125b-5p 在膽囊癌組織中的表達低于對應的癌旁組織（P＜ 0.01），見圖1B。因此，推斷miR-125b-5p 的低表達與膽囊癌的發生密切相關，且選擇GBC-SD 細胞作為實驗細胞進一步研究。

圖1 miR-125b-5p 在膽囊癌細胞和組織中表達降低Fig. 1 The expression of miR-125b-5p was decreased ingallbladder carcinoma cells and tissues

2.2 過表達miR-125b-5p 抑制GBC-SD 細胞增殖和有氧糖酵解

為進一步探索miR-125b-5p 在膽囊癌中的調控作用，分別在GBC-SD 細胞中轉染NC mimic和miR-125b-5p mimic，通過RT-qPCR 檢測發現，NC mimic 組中miR-125b-5p 的表達與NC 組相比無統計學差異（P＞ 0.05），見圖2A。轉染miR-125b-5pmimic 組中miR-125b-5p 的表達明顯高于NC mimic 組（P＜ 0.01）。CCK-8 顯示，過表達miR-125b-5p 可明顯抑制細胞的增殖活力（P＜0.05），見圖2B。糖酵解相關指標檢測表明，過表達miR-125b-5p 組GBC-SD 細胞中乳酸生成量（P＜ 0.001），見圖2C、葡萄糖消耗量（P＜ 0.05），見圖2D 以及ATP 生成減少（P＜ 0.01），見圖2E，LDHA（P＜ 0.01），見圖2F 和G、PDK1（P＜ 0.001）和HK2（P＜ 0.000 1），見圖2F 和圖2G 蛋白表達降低。綜上可知，過表達miR-125b-5p 顯著抑制GBC-SD 細胞增殖以及有氧糖酵解。

圖2 過表達miR-125b-5p 抑制GBC-SD 細胞增殖和有氧糖酵解Fig. 2 Over-expression of miR-125b-5p inhibited the proliferation and aerobic glycolysis in GBC-SD cell

2.3 miR-125b-5p 靶向負調控HK2

通過starBase 數據庫預測發現HK2 與miR-125b-5p 存在靶向結合位點，見圖3A，雙熒光素酶實驗結果表明過表達miR-125b-5p 可顯著抑制HK2 野生型載體的熒光素酶活性（P＜ 0.01），見圖3B，而對突變型HK2 載體的熒光素酶活性無明顯作用（P＞ 0.05）。RT-qPCR 和Westernblot檢測發現，HK2 mRNA（P＜ 0.000 1），見圖3C 和蛋白（P＜ 0.000 1），見圖3D 和圖3E，水平在膽囊癌細胞系GBC-SD 和NOZ 中表達高于膽囊上皮細胞HGBEC，且過表達miR-125b-5p 顯著抑制HK2 mRNA（P＜ 0.01），見圖3F 和蛋白（P＜ 0.001），見圖3G 和圖3H 表達。由此說明miR-125b-5p靶向HK2，且負調控HK2 的表達。

圖3 miR-125b-5p 靶向負調控HK2Fig. 3 miR-125b-5p targeted and negatively regulated HK2

2.4 miR-125b-5p 靶向HK2 抑制GBC-SD 細胞增殖和有氧糖酵解

進一步研究膽囊癌細胞中miR-125b-5p 對HK2 的調控機制，分別在GBC-SD 細胞中轉染NC mimic、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 以 及 miR-125b-5p mimic+pcDNA-HK2，RT-qPCR 檢測發現，轉染miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 組中HK2 mRNA 水平與miR-125b-5p mimic 組相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05），轉染miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 組中HK2 的表達高于miR-125b-5p mimic組（P＜ 0.05）。CCK-8 和糖酵解相關檢指標測發現，同時過表達miR-125b-5p 和HK2 組中細胞增殖活力（P＜ 0.01），見圖4B、乳酸生成（P＜ 0.01），見圖4C、葡萄糖消耗（P＜ 0.05），見圖4D、ATP生成（P＜ 0.05），見圖4E，LDHA（P＜ 0.001），見圖4F 和 圖4G、PDK1（P＜ 0.001），見 圖4F 和圖4G，HK2（P＜ 0.000 1），見圖4F 和圖4G，蛋白表達顯著高于miR-125b-5p mimic+pcDNANC 組。綜上可知，過表達HK2 可逆轉過表達miR-125b-5p 對細胞增殖和有氧糖酵解的抑制作用。

圖4 miR-125b-5p 靶向HK2 抑制GBC-SD 細胞增殖和有氧糖酵解Fig. 4 miR-125b-5p inhibited theproliferationandaerobic glycolysis in GBC-SD cellby targeting HK2

3 討論

膽囊癌是常見的胃腸道癌癥，具有明顯的地域差異。在高發地區，女性的發病率明顯高于男性[12]。盡管診斷技術和治療管理方面取得了很大的進步，但膽囊癌患者的預后仍然較差。研究可靠的生物標志物對膽囊癌患者的臨床診斷和治療至關重要。有氧糖酵解增強是腫瘤細胞的一個顯著特征。雖然有氧糖酵解在產生ATP 方面效率低于無氧糖酵解，但它能促進增殖、抑制凋亡，產生信號代謝物，進而促進細胞在分子壓力下的生存率。因此，研究膽囊癌中糖酵解的產生機制十分重要。

miRNA 在調節生長發育及其他重要的生物學功能中發揮重要作用。目前，大量miRNA 已被作為疾病的診斷生物標志物、癌癥亞型的生物標志物以及治療靶點進行研究[13]。miR-125b-5p 已被報道參與多種疾病的調控。例如：Jin 等[14]報道，敲降miR-125b-5p 可抑制RYBP 的表達，抑制胃癌細胞惡性生物學行為。骨髓間充質干細胞外泌體來源的miR-125b-5p 通過靶向抑制缺血性急性腎損傷中腎小管上皮細胞的P53 表達，從而促進腎小管修復[15]。本研究發現miR-125b-5p 在膽囊癌細胞中表達降低，過表達b 可顯著抑制膽囊癌細胞GBC-SD 的增殖、乳酸生成、葡萄糖消耗、ATP 生成以及LDHA、PDK1 和HK2 蛋白表達。這與Yang 等[16]報道的結果一致，同時，證明過表達miR-125b-5p 可增加順鉑處理后的膽囊癌細胞的死亡，促進癌細胞的化療敏感性。

己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是一種糖酵解酶，促進細胞中葡萄糖代謝，進而催化Warburg 效應。已經在多種癌癥中觀察到HK2 上調，促進腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥性[17-18]。在結直腸癌細胞中，上調HK2 可促進結直腸癌細胞的葡萄糖消耗和乳酸生成及癌細胞的耐藥性[19]。在卵巢癌中，抑制HK2 表達可拮抗卵巢癌細胞的Warburg 效應，抑制卵巢癌發展進程[20]。過表達miR-9-1 顯著降低HK2 蛋白水平，抑制了鼻咽癌細胞的增殖和糖酵解[21]。本研究中，發現HK2 是miR-125b-5p 的靶基因，且負調控HK2的表達。過表達HK2 可逆轉過表達miR-125b-5p對膽囊癌細胞增殖和糖酵解的抑制作用。此外，HK2 也被報道在膽囊癌細胞中作為miR-143 的靶基因，與lncRNA PVT1 共同競爭和miR-143 的結合位點，促進膽囊癌細胞的增殖和轉移[22]。

綜上所述，膽囊癌組織和細胞中miR-125b-5p低表達，過表達miR-125b-5p 靶向抑制HK2 的表達，進而抑制人膽囊癌細胞GBC-SD 的增殖和有氧糖酵解，miR-125b-5p/HK2 分子軸的調控作用可為膽囊癌的臨床診斷和治療提供新的理論依據。