有機肥對環青海湖地區退化草地土壤微生物區系的影響

周學麗， 馬 坤， 王英成， 趙陽安， 祁星民， 土旦加， 史德軍， 蘆光新*， 董世魁

(1.青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2.青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000； 3.北京林業大學草業與草原學院，北京 100083)

土壤微生物是陸地生態系統中重要的組成部分，參與和調節一系列關鍵的養分和物質循環過程[1-2]，土壤微生物群落組成與多樣性作為表征土壤質量和健康的早期指標[3]，同時土壤微生物也有助于植物獲取營養，對維持植物生產至關重要[4]。微生物作為土壤環境變化的指示生物，在植物-土壤-微生物相互作用的生態學過程的研究中越來越受學者們關注[5]。

青海湖地區草地不僅是當地牧民賴以生存的生產基礎，而且具有多種生態系統服務功能和重要的生態安全屏障功能作用。20世紀50年代以來，由于草地畜牧業發展迅速，區域人口和家畜數量快速增長[6]，長期超載放牧導致高寒草地生態系統退化嚴重[7]，嚴重制約草地畜牧業可持續發展[8]，典型脆弱的草地生態系統面臨生態環境保護和社會經濟可持續發展的雙重壓力。草地退化引起我國各級政府及科學界的高度重視[9]，針對青藏高原高寒草甸生態系統退化問題，國家出臺一系列方針政策和開展生態保護工程[10]，實施了多項強有力的恢復措施，包括圍欄封育、草地施肥、鼠害防治以及建植人工草地等，以上措施在青藏高原退化高寒草甸恢復治理中都取得了一定成效[11]。其中，施肥是草地改良和恢復的有效的措施之一，研究表明，施用有機肥對土壤有機碳活性組分提高有顯著的促進作用[12]。施肥后土壤的氮礦化率提高，植物生長加快，土壤有機質增加，從而導致生物群落發生變化[13-14]。近年來，草地和牧草施肥方面的研究及推廣應用發展較為迅速，有關施肥對牧草產量的影響報道很多，主要集中在化學肥料的種類的選擇、營養成分的配比等對草地群落結構及牧草產量的影響方面[15-20]，但在生產實踐中，施用化學肥料勢必會導致成本增加，并且會帶來環境污染問題，不利于高寒草地的生態環境保護[21-22]。鑒于青海省高寒草地生態保護價值，探索施用有機肥對退化草地改良以及保護好青海這片凈土的生態環境、實現農牧業持續健康發展具有十分重要的意義[23]。

迄今為止，通過植被特征或土壤理化性質來反映施肥對草地改良的作用的報道較多[24-26]，也有通過植被-土壤系統的綜合效應來表征施肥效應的研究[27-30]，課題組前期在高寒草地開展進行了有機肥對草地植物和土壤影響的相關研究[31-33]，但有機肥對退化草地土壤微生物群落結構和多樣性影響知之甚少。本文采用高通量測序技術，通過分析16S rRNA和ITS-rDNA基因序列信息，研究環青海湖地區草地土壤微生物群落及多樣性對有機肥的響應特征，明確有機肥對土壤微生物區系的影響，旨在從土壤微生物群落結構與多樣性角度評價施用有機肥對退化草地的改良效果，為該區或同類地區草地改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于青海省草原改良試驗站的天然草地試驗區(37°03′43.0″N，99°34′00.6″E，海拔3 270 m)，年平均氣溫-0.7℃，絕對無霜期為20 d。年平均降水量為368.11 mm，相對濕度58%，年蒸發量1 495.3 mm，土壤為暗栗鈣土，是以紫花針茅為主的高寒草原。樣地于2015年封育，主要植物種類有：紫花針茅(StipapurpureaGriseb)、冷地早熟禾(P.crymophilaKeng)、線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)、豬毛蒿(Artemisiascoparia)、肉果草(Lanceatibetica)、冷蒿(Artemisiafrigida)、青藏苔草(Carexmoorcroftii)、賴草(Leymussecalinus)、溚草(Koeleriacristata)、異葉青蘭(DracocephalumheterophyllumBenth)、阿爾泰狗哇花(Heteropappusaltaicus)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、多枝黃芪(Astragaluspolycladus)、濕生扁蕾(Gentianopsispaludosa(Mun.)Ma.)、狼毒(Stellerachamaejasme)。2020年8月份進行草地植物群落結構調查，樣地植物群落基本特征見表1。依據馬玉壽等[34]草地退化等級劃分，樣地的退化程度介于輕度和中度之間。

表1 樣地植物群落基本特征Table 1 Basic characteristics of plant communities in the sample sites

1.2 試驗設計

于2020年6月，選擇地勢平坦，試驗條件一致的區域，分為2塊50 m × 50 m樣區，試驗分施有機肥與不施有機肥2個處理，施有機肥用F表示，不施有機肥用CK表示，每處理5個重復，分別標記為F1，F2，F3，F4，F5和CK1，CK2，CK3，CK4，CK5。施肥量為800 kg·hm-2(有機質含量>45%，N+P2O5+K2O>5%)(有機肥購自四川省成都市蒲江縣綠地秸稈科技有限公司)，人工均勻撒施。兩個樣區間有1.5 m的緩沖帶，緩沖帶上不做任何處理，試驗設計布置圖見圖1。在試驗處理之前采集土壤樣品，測定土壤理化性質(見表2)。

圖1 試驗布置圖Fig.1 Layout of test plots

表2 土壤理化性質測定Table2 Determination of soil physical and chemical properties

1.3 研究方法

1.3.1土壤樣品采集 2021年8月，分別在2樣區內按對角線取樣法設置5個1 m × 1 m樣方，2個樣區共有樣方10個。在每個樣方內進行植物群落結構調查及土壤樣品采集。在取過地上生物量的樣方內將土壤表層的殘留物和雜質清理干凈，然后用7.5 cm直徑土鉆隨機按0～20 cm鉆取5鉆混合后裝入已滅菌的自封袋中，獲得10個土壤樣品，帶回實驗室，過40目土篩并剔除所有雜質。一份風干后用于測定理化性質，另一份保存在-80℃，用于微生物群落結構分析。

1.3.2土壤理化性質測定 測定的土壤指標有：總氮、有機質、硝氮、氨氮含量。具體測定方法參照鮑士旦的《土壤農化分析》中的相關測定方法[35]。

1.3.3土壤微生物DNA提取、PCR擴增和測序 參照Wang等[36]的方法，采用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA,美國)提取土壤微生物總DNA。采用NanoDrop-ND1000 測定DNA濃度，并經2%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品質量進行檢測，合格后用于構建文庫；以土壤樣品微生物總DNA為模板，分別用16SrDNA V4區(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′ ical propertieserties)；ITS2區5.8F，5′-AACTTTYRRCAAYGG-ATCWCT-3′和4R，5′-AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART-3′且帶有10 bp長的barcode序列的特異引物為擴增引物進行PCR擴增，采用KAPA HyperPrep Kit DNA文庫構建測序文庫。在Illumina Miseq平臺進行測序(深圳，美格基因)。

1.4 數據處理及分析

將所有原始數據以FASTQ格式以及樣本對應的Barcode信息上傳到中科院環境所鄧曄老師課題組的Galaxy分析平臺上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)進行分析。測序數據采用Btrim和FLASH進行過濾優化和雙端序列連接，優質序列利用UPARSE基于97%的相似水平進行OTU(Operational taxonomic units)聚類，并且通過RDP分類數據庫對OTU表進行注釋[37]。基于OTU豐度信息，利用R語言工具制作Venn圖和群落柱形圖，利用Mothur軟件計算微生物群落結構多樣性用物種豐富度(Richness)、Shannon-Wiener多樣性指數、以及Pielou均勻度指數表示，采用PCA法對不同施肥處理和對照中土壤微生物群落的差異進行研究分析；通過Anosim，MRPP以及PERMANOVA三種方法進行相異性檢驗(Dissimilarity test)。

2 結果與分析

2.1 施用有機肥后土壤微生物類群及群落分布特征

2.1.1土壤微生物類群分析 施肥處理和CK的共10個土壤樣本測序后經初步質控檢測得到土壤細菌8 714 371條序列，真菌檢測到5 933 081條序列，在97%的相似性水平下，所有10個樣本得到細菌群落共28 376個OTU(Operational taxonomic unit)，8 493種真菌OTU。施肥處理下土壤中的細菌的OTUs有14 509個，真菌的OTUs有4 183個，與CK相比，施用有機肥增加了細菌群落的OTU，降低了真菌群落的OTU。

2.1.2土壤微生物群落組成及相對豐度的變化 對施肥和CK中土壤細菌和真菌的群落組成及相對豐度進行了分析(圖3)，結果表明：施肥處理和CK土壤中，相對豐度大于1%的細菌門分別為：放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、未分類菌、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、candidate division WPS-1疣微菌門(Verrucomicrobia)等；主要的真菌門分別為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、還有一些未分類菌。由此可見，在門水平上，優勢細菌主要為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)，三者相對豐度之和達87.3%～87.7%；優勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)，相對豐度達92.1%～95.3%。與CK相比，有機肥處理后變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、未分類菌、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes) 的相對豐度較CK均有所增加，但放線菌門(Actinobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 的相對豐度有所下降；子囊菌門(Ascomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)的相對豐度降低，但擔子菌門(Basidiomycota)和未分類菌的相對豐度增加。由圖3可知，在屬水平上細菌群落的組成占比較大的種類除未分類(Unclassified)的種類外，還有Gaiella，Gp6、粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)、Gp16，Gp4、亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)。其中，Gaiella在施肥處理時豐度最高，達到了10.39%；Gp6、粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)以及Gp16在其中的豐度相對穩定，平均豐度分別是4.23%，5.10%和3.93%。并且Gp6在施肥處理中豐度達到5.7%，粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)在CK處理中含量占6.99%。Gp16在施肥處理中豐度占5.36%。

圖3 土壤中細菌群落(A)和真菌群落(B)門水平組成分析,細菌群落(C)和真菌群落(D)屬水平組成分析Fig.3 Analysis of the composition of bacterial community (A) and fungal community (B) phylum level,bacterial community (C) and fungal community (D) genus level in soil

真菌群落組成中，排在前五位的屬有未分類(Unclassified)、Preussia、赤霉菌屬(Gibberella)、擬桿菌屬(Pseudeurotium)、炭疽病菌(Atradidymella)、粉孢菌屬(Podospora)。Preussia在施肥處理后含量反而有所下降，施肥處理后Preussia菌屬下降了21.54%，而赤霉菌屬(Gibberella)在施肥處理后明顯增加。擬桿菌屬(Pseudeurotium)影響變化不大，平均豐度在5.69%。

2.1.3土壤微生物群落分布特征的影響 采用Bray距離對草地土壤細菌和真菌群落結構進行主成分(PCA)分析，如圖4所示，施肥處理草地土壤的樣品和對照樣品在主坐標分析圖上相對分離，說明施肥改變了土壤細菌群落和真菌群落的結構。對于細菌群落來說PCA1對土壤細菌群落結構差異的解釋率為20.36%，PCA2的解釋率為14.84%，兩軸解釋率總和為35.2%(圖4A)。在施有機肥和對照土壤中，細菌群落結構均表現顯著差異(P<0.05)，表明施有機肥顯著改變了草地土壤細菌群落結構。對于真菌群落PCA1對土壤真菌群落結構差異的解釋率為20.83%，PCA2的解釋率為16.49%，兩軸解釋率總和為37.32%(圖4B)。在施有機肥和對照土壤中，真菌群落結構均表現顯著差異(P<0.05)，表明施肥改變了草地土壤真菌群落結構。不相似性檢驗分析進一步表明施用有機肥顯著改變了細菌群落和真菌群落結構(表3)。

圖4 土壤細菌群落A和真菌群落B的PCA分析Fig.4 Principal coordinate analysis of bacterial community (A) and fungal community (B) in natural grassland soil

表3 天然草地不同處理間微生物的不相似性檢驗結果Table 3 Results of dissimilarity test of microorganisms among different treatments of natural grassland

2.2 施用有機肥后土壤微生物多樣性分析

細菌群落的樣品文庫覆蓋率為96.3%～96.6%，真菌群落的樣品文庫覆蓋率為97.7%～99.9%，表明制備文庫覆蓋了施肥處理土壤樣品中96.3%以上的細菌和真菌類群，庫存容量足夠反映樣品中微生物的真實組成。

如圖5所示，對施肥處理與對照中土壤細菌和真菌的Richness指數對比分析發現，施有機肥增加了土壤細菌群落的Richness指數，但降低了真菌群落的Richness指數；對施肥處理與對照中土壤細菌和真菌的Chao1指數對比分析發現，施肥處理降低了細菌群落的Chao1指數，但增加了真菌群落的Chao1指數。有機肥處理下細菌和真菌群落的Simpson，invsimpson指數均出現下降趨勢,細菌和真菌的ACE指數均出現上升趨勢。對施肥和對照中微生物Shannon和Pielou指數分析結果顯示，有機肥降低了細菌和真菌群落的Shannon和Pielou指數，表明施用有機肥對細菌和真菌兩大類群的影響不同。施有機肥能夠增加細菌的豐富度，但減少了多樣性和均勻度。而對真菌而言，施肥處理后豐富度、多樣性和均勻度都有所降低。

圖5 土壤微生物α多樣性Fig.5 Diversity of soil microorganism

2.3 施用有機肥后指示微生物類群分析

為了進一步研究施肥對土壤細菌與真菌群落的影響，采用LEfse(LDA effect size)分析了施肥處理與對照中土壤的指示微生物。如(圖6A)所示，施肥土壤的細菌指示物種為Gammaproteobacteria，對照土壤的細菌指示物種是Actinomarinicota。施肥土壤的真菌指示物種是Dothideomycetes，對照土壤的真菌指示物種是Helotiaceae(圖6B)。

圖6 施肥草地土壤微生物群落的線性判別分析Fig.6 Linear discriminant analysis of microbial community fertilization in natural grassland soil.

3 討論

草地生態系統是陸地生態系統的重要組成部分，高寒地區的草地退化主要表現為草地沙化、出現黑土灘或草地鹽堿化[38]。草地退化和改良過程中土壤養分的富集和虧缺，將對植物生產力和微生物群落產生實質影響。為進一步明確有機肥對高寒地區草地土壤微生物群落和多樣性的影響，本文對比分析了施有機肥處理與對照之間土壤微生物類群、群落組成、多樣性以及關鍵物種進行了分析。結果發現，施用有機肥后的第二年土壤微生物多樣性和群落組成發生了變化，細菌和真菌兩大類群對施用有機肥的響應表現出了差異，這與其微生物類群的生物學特性有關。即：施用有機肥增加了土壤有機質含量，更利于細菌的生存。而在草地土壤中，大部分真菌可以將大分子有機物分解成小分子的化合物，供菌體吸收和利用，推動土壤養分的循環，維持和完成正常的生命活動[39]。另外，微生物的功能和特征隨其棲息的草地土壤環境的溫度、濕度、土壤養分以及分布的植物種類也發生變化[40-41]。

通過有機肥對微生物群落多樣性的影響分析發現，有機肥處理增加土壤細菌群落的豐富度，而降低了土壤真菌群落的豐富度，相關細菌群落變化規律與多數研究結果一致[42-43]。對微生物群落組成而言，施有機肥改變了土壤細菌群落和真菌群落的結構，指示物種也發生了變化，施肥對土壤細菌與真菌群落結構變化有顯著的影響，這說明施用有機肥后草地土壤環境發生了變化，并且對地上植物部分從物種、功能群以及群落水平上都發生了結構性變化[44]，土壤微生物群落的這些變化可能與植被特征和土壤理化性質的改變有關[45]。

4 結論

青藏高原環青海湖地區施用有機肥第二年，土壤細菌的OTUs增加，真菌的OTUs降低；并且改變了土壤細菌與真菌群落組成及相對豐度；有機肥添加能增加土壤細菌群落的Richness指數，降低了真菌群落的Richness指數，同時降低細菌群落的Chao1指數，增加真菌群落的Chao1指數，細菌和真菌群落的Shannon和Pielou指數均明顯降低；施肥處理后土壤細菌和真菌的指示物種也發生了變化。