單糖特征分析在腹膜透析相關性腹膜炎病原菌診斷中的價值

公智卿，陳懌鵬，盧冬梅，辛麗麗，郭 菁，邢廣群

(青島大學附屬醫院 腎病科，山東 青島 266555)

腹膜透析相關性腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)是腹膜透析常見的并發癥，可以影響腹膜的結構和功能，并引起腹膜透析技術失敗以及嚴重的包裹硬化性腹膜炎，危及患者生命。對病原體的及時精準診斷、盡早選用敏感的抗生素是最有效的措施[1-2]。腹膜炎的主要致病菌有細菌和真菌，覆蓋細菌表面的復雜多聚糖網絡在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌之間是不同的，革蘭陰性菌被兩層細胞膜包裹，兩層細胞膜被一層肽聚糖層隔開，并在外膜中含有脂多糖。相比之下，革蘭陽性細菌細胞膜只有厚厚的肽聚糖層覆蓋[3]。細菌多糖通常是由雙糖至八糖形成的規則的重復單位構成，這些聚糖的精確結構可能在具有相同細胞表面結構的細菌之間存在顯著差異，甚至在同一細菌物種的不同菌株之間也可能存在差異[4]。構成細菌常見的單糖有甘露糖、葡萄糖、巖藻糖等。革蘭陰性菌中含有的脂多糖是由脂質A，核心多糖和O抗原組成的脂質和多糖的復合物，Milan Manani等[5]研究表明，革蘭陰性菌腹膜炎患者的透析液中脂多糖水平較革蘭陽性菌腹膜炎腹透液和正常腹透液顯著升高。真菌細胞壁中含有半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖，其在真菌生長和組織侵襲過程中會釋放到周圍環境中，Worasilchai等[6]研究表明，檢測腹膜透析液中半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖的含量可以作為真菌性腹膜炎的早期診斷。

目前對腹膜炎患者腹膜透析液中單糖研究較少，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)具有應用范圍廣、分析速度快、敏感度高和耐鹽污染等優點，廣泛應用于降解后單糖含量測定、食品中成分測定、藥物含量測定等領域[7]。Trezzi 等[8]應用色譜法研究表明，測定腦脊液中單糖成分變化可以用于早期診斷帕金森病。因此，本研究將應用高效液相色譜法對腹膜透析液中由多聚糖降解后的單糖水平進行分析，探究腹膜透析相關性腹膜炎患者腹透液中單糖水平的差異。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2020年10月01日到2021年10月31日到青島大學附屬醫院西海岸腎病科住院的透析齡>3個月、年齡≥18歲的腹膜透析患者90例，收集患者腹膜透析液樣本，包括無腹膜炎腹膜透析液樣本52個，腹膜炎腹膜透析液樣本38個，其中革蘭陽性菌腹膜炎腹膜透析液樣本24個，革蘭陰性菌腹膜炎腹膜透析液樣本14個。PDAP的診斷標準：參照2022年國際腹膜透析協會 (ISPD)指南, 符合以下3項中2項及以上者可診斷為PDAP：(1)腹痛和(或)透出液渾濁，伴或不伴發熱；(2)透出液白細胞計數超過100×106/L，其中多形核中性粒細胞達50%以上；(3)透出液微生物培養陽性[1]。本研究獲得青島大學附屬醫院倫理委員會批準(審批文號：QYFYWZLL26672)。

1.2實驗與方法

1.2.1實驗儀器 PCR儀(T100 Thermal cycler)購于新加坡Thermal Cycler公司；渦旋振蕩器(VG 3 S25, VORTEX GENIUS3)購于德國IKA 儀器設備有限公司；掌上離心機(LX-100)購于江蘇其林貝爾儀器有限公司；高速離心機購于美國Thermo公司；磁力攪拌器(C-MAG HS7)購于德國IKA 儀器設備有限公司；高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1260/1290)、Eclipse XD B-C18 色譜柱(150 mm*4.6 mm，5 μm)購于美國Agilent公司；超聲波振動清洗器(KH7200E)購于昆山禾創超聲儀器有限公司；電子天平(TP-213 型)購于北京丹佛儀器有限公司；PH 計(雷磁 PHs-3C)購于上海精密科學儀器有限公司；Simplicity UV 純水儀購于德國Millipore公司；烘箱購于上海三發科學儀器有限公司。

1.2.2實驗試劑 三氯甲烷購于天津科密歐化學試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于美國Sigma Aldrich 公司；單糖標準品購于美國Sigma公司，色譜甲醇、乙腈、甲醇均購于Merck公司濃鹽酸溶液、NaOH溶液、乙酸銨、冰醋酸均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.3方法 留取無腹膜炎患者入院當天腹透液和腹膜炎患者初入院經驗性抗生素使用之前的第一袋1.5%葡萄糖濃度的腹膜透析液，無菌操作采集患者留腹>2 h的腹膜透析液20 ml，放入-80 ℃冰箱中保存，同時抽取20 ml注入需氧、厭氧血培養瓶中。將所有收集的腹膜透析液樣本一式三份，測定3次單糖濃度取平均值。取5 μl腹膜透析液加入八連管的底部。八連管加蓋后放入PCR儀中，溫度設置為100 ℃, 降解10 min。經過一系列實驗處理后，最終取50 μl上清液于棕色上樣瓶內，隨后用HPLC進行色譜分析[檢測波長245 nm；色譜柱溫37 ℃；進樣量20 μl；流速1 ml/min；流動相配置：85%乙酸銨-乙酸緩沖溶液(PH=5.5)、15%乙腈][9]。

2 結 果

2.13組臨床資料比較 腹膜炎組與無腹膜炎組在體質量指數(BMI)、白蛋白、C反應蛋白(CRP)、血鈉、血鈣、血磷上差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。腹膜炎組與無腹膜炎組甘露糖、葡萄糖和巖藻糖的濃度差異均有統計學意義(P<0.01)。革蘭陽性菌腹膜炎組與革蘭陰性菌腹膜炎組甘露糖濃度差異有統計學意義(P<0.01), 見表1～2。 腹膜透析相關性腹膜炎病原菌構成見表3。

表1 3組臨床資料比較

表2 腹膜透析液降解單糖濃度比較(μmol/L)

表3 腹膜透析相關性腹膜炎病原菌構成情況

2.2Logistic回歸分析 對無腹膜炎組和腹膜炎組進行logistic回歸分析示，巖藻糖濃度是腹膜炎發生的獨立危險因素(P<0.01), 見表4。對革蘭陽性菌腹膜炎組和革蘭陰性菌腹膜炎組進行亞組分析，根據ROC曲線結果，對甘露糖濃度進行賦值后行logistic回歸分析，結果表明甘露糖濃度是革蘭陽性菌腹膜炎發生的獨立危險因素(P<0.01), 見表5～6。

表4 腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

表5 變量賦值說明

表6 革蘭陽性菌腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的AUC是0.820，95%CI(0.732，0.908)，敏感度為71.05%，特異度為84.62%，最佳截斷值為3.045 μmol/L。降解甘露糖對革蘭陽性菌腹膜炎診斷的AUC是0.863, 95%CI(0.740，0.986)，敏感度為78.57%，特異度為83.33%，最佳截斷值為0.345 μmol/L, 見圖1～2。

圖1 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的ROC曲線 圖2 降解的甘露糖診斷革蘭陽性菌腹膜炎的ROC曲線

3 討 論

在全球范圍內，腹膜透析相關性腹膜炎的發生率估計為0.24～1.66次/患者年[1]。傳統的病原菌實驗室培養時間長，耗時約為3～5 d，培養陽性率與腹水中病原菌數量和種類密切相關，有些患者雖然有非常明確的細菌感染炎癥表現，腹膜透析液培養的病原學卻是陰性，影響了抗生素的選擇和治療。基于此，國內外一直在不斷探索改進檢測手段。目前有質譜檢測、16s rRNA基因測序、納米材料檢測等均可以減少培養時間，有一定的敏感度和特異度，但成本高昂、不能提供藥敏信息、需要特殊檢測儀器等問題，限制了它們的應用[10-13]。

本研究利用HPLC，通過酸降解和PCR后進行色譜分析，檢測腹膜透析液中降解的單糖水平，發現腹膜透析相關性腹膜炎患者的透析液相較于無腹膜炎患者的透析液，降解的葡萄糖、巖藻糖含量是顯著降低的，甘露糖濃度在革蘭陽性菌腹膜炎感染中也是降低的。腹膜透析液中葡萄糖濃度的變化對腹膜透析相關性腹膜炎的患者而言沒有意義，主要有以下原因：不同的患者腹膜功能不同，腹膜透析液的留腹時間、腹膜透析液的葡萄糖濃度不同和腹腔內病原體生長消耗都會影響葡萄糖的濃度。巖藻糖和甘露糖濃度的降低考慮與腹腔內病原體生長消耗、體內炎癥狀態等有關。與革蘭陽性菌腹膜炎組相比，革蘭陰性菌腹膜炎組腹膜透析液中甘露糖的水平高，首要考慮是因為覆蓋細菌表面的復雜聚糖網絡在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌之間有所不同。其次，既往研究顯示，腹膜透析液中甘露糖濃度升高，對革蘭陰性菌感染引起的炎癥反應具有抑制作用，與機體自身的免疫反應有關[14-15]。在臨床上，我們對遇到的3例培養陰性的腹膜炎患者進行腹膜透析液的甘露糖濃度檢測，結果提示有2例患者的腹膜透析液甘露糖濃度小于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陽性菌感染，給予對革蘭陽性菌敏感的頭孢唑林后治愈；1例患者的甘露糖濃度大于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陰性菌感染，給予對革蘭陰性菌敏感的頭孢他啶后治愈，這進一步驗證了我們的研究成果。

綜上，本研究發現，腹膜透析相關性腹膜炎發生時，降解的巖藻糖水平明顯下降，對腹膜炎有明確的提示作用；檢測腹膜透析液的甘露糖濃度可以早期鑒別革蘭陽性菌腹膜炎及革蘭陰性菌腹膜炎。HPLC相較于基因測序，檢測時間短、檢測成本低，對臨床上早期判斷病原菌種類，選用適當抗生素有一定的指導意義。本研究為單中心研究，病例數較少，沒有納入真菌性腹膜炎患者，檢測單糖種類較少，還需要進一步對結果進行驗證。