火焰原子吸收光譜法測定甲鈷胺中游離鈷含量

梅雪嬌 閆翔宇 嚴相平

甲鈷胺是一種維生素B12的衍生物[1-2]，主要用于治療周圍神經病[3-6]。甲鈷胺屬于B 族維生素的一種，也是人體內唯一一種含有金屬元素的維生素[7-8]。而在藥品中，元素雜質是受到嚴格控制的。甲鈷胺的合成工藝顯示，甲鈷胺是通過氰鈷胺經還原、甲基化，得到含甲鈷胺的溶液，再經過精制得到終產品[9]，因此可能存在潛在的游離鈷元素。元素雜質指導原則ICH Q3D 中，根據各元素的毒性（每日允許暴露量）及其在藥品中出現的可能性，將元素雜質分為3 類。1 類是人體毒素，在藥品生產中應限制使用或禁用。2 類是給藥途徑依賴型的人體毒素。根據它們出現在藥品中的相對可能性，進一步分成2A 和2B 亞類，其中2A 類元素出現在藥品中的相對可能性高，2B 類元素豐度較低并且與其他物料共生的可能性較低，因此出現在藥品中的概率較低。鈷在藥物元素雜質研究中應歸屬于2A 類無機雜質，因此通過測定甲鈷胺中游離鈷的含量，可以表征工藝清除無機雜質的能力。

由于甲鈷胺結構本身含鈷，必須進行樣品前處理。如何將游離鈷與結構鈷分離，是測定游離鈷的關鍵和難點。本研究采用大孔吸附樹脂[10]對甲鈷胺進行分離純化，使游離鈷從甲鈷胺中洗脫。鈷元素的測定多采用原子吸收光譜法、原子發射光譜法及化學法[11-12]，火焰原子吸收法檢出限低，靈敏度高，分析精度好，因此本文以原子吸收法測定游離鈷含量。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀器

原子吸收分光光度計（島津AA/GFA-6880）；WizAArd 工作站；分析天平（賽多利斯BT25S）。

1.2 藥品與試劑

甲鈷胺原料藥（無錫福祈制藥有限公司，批號：20160402、20160403、20160404）；非極性大孔吸附樹脂（Amberlite XAD 1600N）；鈷單元素標準液（1000 μg/ml，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，唯一標識：17B053-2）；優級純硝酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20191213）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200103）；鹽酸（南京化學試劑股份有限公司，批號：190910089H）；氫氧化鈉（南京化學試劑股份有限公司，批號：190826978E）；超純水。

2 方法與結果

2.1 原子吸收光譜儀的參數

分析波長：鈷240.7 nm；狹縫寬：0.2 nm；燈電流Low（峰值）：12 mA；點燈方式：BGC-D2；燃燒器高度：7 mm；燃燒器角度：0°；乙炔氣流量：2.2 L/min；助燃氣流量：15.0 L/min；助燃氣的類型：空氣。

2.2 溶液的制備

空白溶液及洗脫劑：0.2%硝酸溶液。樹脂活化處理：將XAD1600N 樹脂裝柱，加無水乙醇浸泡12 h，洗脫2～3 倍柱體積，再浸泡3 h，洗脫，浸泡，洗脫，再加2%鹽酸浸泡，洗脫，水洗至pH 值中性，加2%氫氧化鈉浸泡，洗脫，水洗至pH 值中性[13]。裝柱：選用帶漏斗口的開口玻璃柱，內徑1.0 cm 左右，濕法填裝已活化處理后的樹脂，柱床高度約20 cm。上樣：稱取50 mg 樣品，用1 ml 濃度0.2%的硝酸溶解，小心分次上柱，并用總體積2 ml 左右的0.2%硝酸洗滌樣品瓶，將洗液上柱。上柱時，控制流速均勻滴液，初始的3～5 ml 流出液不接收。洗脫：用洗脫劑進行洗脫，接收洗脫液至50 ml 量瓶中，接收至快到刻度時停止接收，加0.2%稀硝酸至刻度。

2.3 線性關系、定量限及檢出限

精密量取1 ml 鈷單元素標準液至20 ml 量瓶加0.2%硝酸定容制成50 μg/ml 鈷標準儲備液，再分別取0、0.5、1.0、2.0、3.0 ml 于50 ml 量瓶中加0.2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線溶液。取空白溶液，連續測定11 次，由11 次吸光值讀數的標準偏差（SD）計算檢出限（3SD/K）和定量限（10SD/K），K為線性方程的斜率。取標準曲線溶液進樣，以濃度C（μg/ml）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：A=9.586×10-2C+5.479×10-3。根據標準曲線的斜率及11 次空白溶液吸光值的SD 值，計算鈷的定量限為0.245 3 μg/ml，檢出限為0.073 60 μg/ml。

2.4 樣品測定

取供試品溶液進樣，依法測定，讀出供試品溶液中吸光度，按上述標準曲線計算含量，結果3 批原料藥中20160402 批、20160403 批及20160404 批原料中游離鈷的量分別為未檢出、未檢出、0.010 4%。

2.5 重復性試驗

稱取20160404 批原料6 份，同“2.4”樣品測定項下方法測定并計算鈷含量。見表1。結果表明該方法重復性良好。

表1 重復性試驗

2.6 加樣回收率試驗

精密量取鈷單元素標準液適量，加0.2%硝酸定容至刻度制成10 μg/ml 鈷標準儲備液。稱取20160404批原料9 份，每份50 mg；精密量取鈷標準儲備液0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml，用0.2%硝酸稀釋至1 ml，制備成分別含游離鈷低、中、高濃度的同體積溶液各3 份，按樣品溶液的制備方法，將其加入樣品中使樣品溶解后小心分次上柱，并用總體積2 ml 左右的0.2%硝酸洗滌樣品瓶，將洗液上柱。接收洗脫液至50 ml 量瓶中，接收至快到刻度時停止接收，加稀硝酸至刻度，制成低、中、高濃度加入量與所取供試品中待測成分量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1 的回收率溶液。依法測定，計算回收率。見表2。結果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗

3 討論

3.1 不同型號大孔樹脂吸附能力比較

非極性聚合物大孔吸附樹脂是由偶極矩較小的單體聚合制得，這類樹脂結構不帶任何功能基，因而孔表的疏水性較強，可通過與小分子內的疏水部分的作用吸附溶液中的有機物。常見型號有XAD-1600N、D-101、D3520、HP-20 等。不同型號的樹脂對同一物質的分離純化效果是不同的，本研究擬采用不同型號的非極性聚合物大孔吸附樹脂，對甲鈷胺已確定游離鈷含量的原料（20160404 批）進行分離純化，并以“2.6”加樣回收率試驗項下方法測定并計算回收率，對甲鈷胺中游離鈷的分離純化水平進行評估。骨架材料均為苯乙烯-二乙烯苯類的各型號大孔樹脂試驗結果顯示：XAD-1600N 型大孔樹脂（比表面積≥800 m2/g，平均孔徑150 ?，購于陶氏）回收率為100.9%、D3520 型大孔樹脂（比表面積≥480 m2/g，平均孔徑85～90 ?，購于陶氏南開大學化工廠）回收率為89.66%、D-101 型大孔樹脂（比表面積≥550 m2/g，平均孔徑90～100 ?，購于天津市西金納環保材料科技有限公司）回收率為92.22%、HP-20 型大孔樹脂（比表面積≥590 m2/g，平均孔徑290 ?，購于日本三菱）回收率為90.65%。從各型號大孔樹脂分離純化后測定游離鈷的平均回收率數據結果看，XAD-1600N 型大孔樹脂分離純化效果最好，但不同型號樹脂的適用范圍不同，且不同廠家的樹脂質量不同，吸附能力、洗脫能力也會有所差異，本試驗結果僅供參考。

3.2 不同徑高比比較

樹脂的用量會影響目標成分的吸附情況，樹脂用量過少，不足以吸附甲鈷胺，用量過多，會造成死吸附，游離鈷不易洗脫，擬比較不同徑高比游離鈷的洗脫情況。用XAD-1600N 型大孔樹脂對同一批已確定游離鈷含量的樣品分別于徑高比1∶5、1∶10和1∶20 下進行洗脫，發現樹脂用量較少時，甲鈷胺的特征色紅色無法吸附于柱頂部，當徑高比在1∶20 時，甲鈷胺能夠得到充分吸附，與游離鈷分離。值得注意的是填充柱體積一定不能過大，過大了洗脫所需的溶劑體積增多，需接收至少3 倍柱體積洗脫液，導致溶液濃度下降，無法達到檢測靈敏度要求。

3.3 洗脫速度比較

洗脫劑的洗脫體積流量是影響分離純化效果的關鍵因素之一。經研究發現，洗脫體積流量太低，會導致洗脫速度過慢，延長操作時間，效率低；而洗脫體積流量太高，又會導致洗脫劑與游離鈷接觸時間短，不能從樹脂上被充分洗脫出來，解吸附效率低。用XAD-1600N 型大孔樹脂，以不同洗脫速度，對甲鈷胺同批原料（20160404 批），以“2.6”加樣回收率試驗項下方法分別測定洗脫速度為0.50 ml/min、1.0 ml/min、2.0 ml/min 時，接收樣品總需時間，并計算回收率，對甲鈷胺中游離鈷的分離純化水平進行評估。試驗結果顯示：洗脫速度為0.50 ml/min 時，接收樣品總需時間為65 min，回收率99.65%；洗脫速度為1.0 ml/min 時，接收樣品總需時間為30 min，回收率101.5%；洗脫速度為2.0 ml/min 時，接收樣品總需時間為15 min，回收率85.12%。綜合以上試驗數據，證明洗脫速度不宜過快，建議控制速度為30 min 或更長時間接收一份樣品。

3.4 方法評價

本實驗通過采用大孔樹脂吸附，使甲鈷胺中的結構鈷與游離鈷分離，通過實驗證明本法精確度高、專屬性強，解決了游離鈷與主成分分離的技術難點。本研究為分析技術的難點提供了一些解決辦法與思路，通過運用現代的分析手段解決當前的技術瓶頸，從而大幅提高檢驗效率，可為原料藥的質量監控提供有效的數據支撐。