Mito-OS-Timer：一種靶向監(jiān)測線粒體氧化應激的熒光秒表

張小妮 翁伊純 范奕浩 王曉娟 趙佳宇 張云龍

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

線粒體是真核細胞的氧化供能中心，進行生物氧化和能量轉換時常伴隨著“活性氧”的產生，活性氧會造成線粒體內膜通透性加強，膜內外離子濃度的失衡，這種活性氧產生與抗氧化系統(tǒng)失衡狀態(tài)被稱為線粒體氧化應激（mitochondrial oxidative stress，Mito-OS）［1］。 活 性 氧 簇（reactive oxygen species，ROS）包括超氧陰離子自由基（O2-）、羥基自由基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等，ROS介導的氧化應激會造成線粒體的結構改變和功能障礙，即線粒體損傷［2］。此外，ROS還可以激活各種轉錄因子，例如細胞色素C轉移酶、BAX、Caspase 等［3］。線粒體功能障礙會破壞細胞、組織和器官功能，進而引發(fā)衰老或多種疾病，如癌癥、心血管疾病、神經退行性疾病以及肝腎疾病等，因此，線粒體已成為診治疾病的一個新靶點［4-5］。

探究線粒體氧化應激機理及其相關疾病發(fā)生機制，探索氧化損傷預防措施和開發(fā)抗氧化應激治療候選藥物等過程，穩(wěn)定可靠的氧化應激細胞或動物模型是必需條件。目前，氧化應激細胞模型主要通過H2O2誘導構建；而動物模型主要包括兩類：一是非特異性模型，即針對動物組織器官造成全身性氧化損傷的模型，如D-半乳糖模型［6］、輻照模型［7］、臭氧損傷模型［8］等；另一類為特異性模型，即針對動物某個組織器官造成靶向損傷，如溴化苯模型［9］、阿霉素模型［10］、四氧嘧啶模型［11］、尼古丁損傷模型［12］和谷氨酸模型［13］等。為了確保模型的穩(wěn)定性，評價標準尤為重要，現(xiàn)有氧化應激的評價指標主要有直接和間接兩種類型：直接指標主要針對氧自由基的產生量，Sánchez等［14］曾利用自由基分析儀檢測仔豬斷奶應激引起的血清中O2-、H2O2、NO等自由基的產生量；間接指標則針對抗氧化劑的質量濃度或活性，包括總氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）等。然而，上述評價方法都是基于氧化應激導致的細胞形態(tài)學變化、動物表型變化或特征代謝產物生成情況等進行的，無法實現(xiàn)實時監(jiān)測動態(tài)變化情況，并存在一定的不穩(wěn)定因素。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的問世為生命科學領域點亮了一盞明燈，隨后錢永健等科學家們開發(fā)出多種不同顏色的熒光蛋白，借助融合蛋白構造“熒光分子探針”為蛋白質定位、示蹤及其相互作用等研究提供技術支持。但單色熒光蛋白在空間定位和示蹤方面存在不足。Terskikh等［15］采用易錯PCR方法改造紅色熒光蛋白drFP583，篩選到一種四聚體的突變體，命名為DsRed1-E5，熒光顏色可隨時間推移由綠色（激發(fā)光和發(fā)射光最大波長：483 nm和500 nm）不可逆地轉變?yōu)榧t色（激發(fā)光和發(fā)射光最大波長：558 nm和583 nm），由于DsRed1-E5初表達產物在激發(fā)光下顯示綠色熒光，隨著Tyr（67）不斷氧化。顏色轉變速率不受蛋白濃度、pH值和離子強度影響，但溫度、光照和氧濃度會影響其紅綠熒光比［16］。Hernandez等［17］首次構建了一種靶向線粒體的熒光計時器“MitoTimer”，即將熒光蛋白DsRed1-E5與定位線粒體內膜的細胞色素C氧化酶COX8A亞基融合，初步證實可用于檢測線粒體發(fā)生。

本文報道了一種真核細胞線粒體氧化應激的熒光報告系統(tǒng)，命名為“線粒體氧化應激熒光監(jiān)測系統(tǒng)”（mitochondrial oxidative stress fluorescent timer，Mito-OS-Timer），并利用Mito-OS-Timer驗證了FLCN基因表達異常可促發(fā)線粒體氧化應激，證明該系統(tǒng)可監(jiān)測線粒體氧化應激的動態(tài)變化情況，這為氧化應激細胞模型的評價建立了一種新方法，也為開發(fā)動物模型相關評價方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與細胞系 E.coli DH5α感受態(tài)細胞、人胚胎腎細胞HEK 293T為本實驗室備存。重組 質 粒 pLVX-shRNA、pcDNA-3HA-FLCN、pCMVHalo-FLCN為本實驗室備存，pLVX-MitoTimer購于優(yōu)寶生物公司；pLVX-Mito-OS-Timer委托通用生物公司合成。

1.1.2 試劑與設備 DMEM培養(yǎng)基、2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、魚藤酮和青霉素-鏈霉素購自Sigma公司；QuaCellTM特級胎牛血清購于上海益啟公司；GAPDH購自Bioss公司；D-PBS、Lipo 8000TM轉染試劑購于碧云天公司；H2O2購自國藥集團；質粒中提試劑盒購自Magen公司；CO2培養(yǎng)箱購自Sigma公司；Western轉膜儀和凝膠成像儀購自Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自徠卡公司；流式細胞儀購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pLVX-shFLCN構建與擴增 常規(guī)PCR方法擴增FLCN基因，上游引物：5′- TATAGA ATTCATGAATGCCATCGTGGCTCTC-3′；下游引物：5′-ATATCTCGAGGTTCCGAGACTCCGAGG-3′，以 pCMVHalo-FLCN為模板。pLVX-shRNA載體與PCR擴增片段用EcoR I和Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶進行連接并轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選和擴增的陽性克隆，抽提重組質粒并委托上海生工測序，經BLAST分析正確的克隆-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

將含pLVX-shFLCN重組質粒的陽性克隆菌接種至含氨芐的3 mL LB培養(yǎng)基進行擴增，37℃，225 r/min過夜搖菌培養(yǎng)至約OD600=0.5，經中提試劑盒抽提質粒，以去除內毒素后，Nano Drop檢測定量后備用。

1.2.2 細胞轉染 將HEK 293T細胞培養(yǎng)于24孔板內，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1∶1 000 Penicillin-Streptomycin），待細胞長至60%左右，0.8 μL Lipo8000TM轉染試劑、25 μL Opti-MEM與500 ng pLVX-shFLCN重組質粒混勻，室溫靜置5 min。加入到孔板中轉染4 h，換液并添加2 μg/mL強力霉素（doxycyclin，簡稱Dox）誘導表達，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.2.3 ROS水平檢測 HEK 293T細胞培養(yǎng)于24孔板中，待細胞長至約90%時，采用0、10、50、75、100 μmol/L H2O2避光處理，37℃，5% CO2避光培養(yǎng)6 h，D-PBS洗1次，加入 10 μmol/L DCFH-DA，室溫避光孵育20 min。D-PBS洗3次后，為減少熒光淬滅影響實驗結果，應立即倒置熒光顯微鏡（激發(fā)光/發(fā)射光=488/535 nm）10倍放大率下觀察熒光情況。在無細胞區(qū)域進行背景熒光校正后獲取熒光圖。

1.2.4 流式細胞術分析 6孔板培養(yǎng)HEK 293T細胞，待長至70%以上，200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基、3.2 μL Lipo8000與2 μg轉染質粒混勻，室溫靜置5 min，將混合試劑滴加在孔板中，使細胞轉染質粒4 h，更換完全DMEM培養(yǎng)基（10% FBS，1∶1 000 P/S）培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，D-PBS洗1次，300 μL胰蛋白酶消化1 min，加入400 μL培養(yǎng)基終止消化。將細胞液轉到1.5 mL EP管中1 900 r/min離心5 min，棄去上清，1 mL D-PBS重懸，1 900 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定10 min，1 900 r/min離心5 min后吸出875 μL的4%多聚甲醛，向剩余溶液中加入375 μL的D-PBS重懸，將樣品用流式細胞儀進行分析，選擇FITC和PE通道分別篩選綠色與紅色熒光信號。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞內熒光強度，由于紅綠熒光光譜有明顯疊加現(xiàn)象，因此計算結果時需要去除干擾值。通過分別轉染Mito-DsRed和Mito-GFP，確定紅綠熒光間相互干擾值。所有實驗均獨立重復至少3次，所有值均為x-±s，然后采用GraphPad Prism 6分析制圖。

2 結果

2.1 熒光秒表Mito-OS-Timer系統(tǒng)的建立與評價

2.1.1 Mito-OS-Timer實時監(jiān)測H2O2誘導細胞模型的線粒體氧化應激狀態(tài) 線粒體氧化應激細胞模型建立首先采用常規(guī)H2O2誘導法，如圖1所示，經0、10、50、100、200 和 300 μmol/L H2O2誘導線粒體處于氧化應激狀態(tài)，ROS使用DCFH-DA檢測氧化應激水平。為保證采集面積一致，細胞群體的采集指標是視野熒光集合采集。用Image J分析獲得平均熒光強度（該區(qū)域熒光強度總和除以該區(qū)域面積）。據(jù)實驗結果統(tǒng)計分析，未添加H2O2處理的綠色熒光強度為18.7，隨著H2O2濃度的增加綠色熒光強度隨之增加，當H2O2濃度達到300 μmol/L時熒光強度升高至22（圖1-B）。上述實驗結果表明，隨著H2O2濃度增加細胞線粒體內產生的ROS水平增加，即成功的構建了線粒體氧化應激細胞模型。

圖1 H2O2誘導氧化應激細胞模型的評價Fig.1 Evaluation of H2O2-induced oxidative stress cell model

熒光秒表Mito-OS-Timer系統(tǒng)主要借助于可變色熒光蛋白DsRed1-E5紅綠熒光變化與活性氧濃度線性相關，并設計利用線粒體內膜的ATP合酶亞基ATP5PB的定位區(qū)域編碼基因與DsRed1-E5基因融合，正如圖2-A所示，啟動序列采用pLVX啟動子模塊，Timer序列前插入Kozak序列，提升翻譯啟動效率。Kozak序列通常位于真核生物mRNA 5′端帽子結構下游的一段高度保守序列，通常為GCCACCAUGG，它與翻譯起始因子結合而介導mRNA翻譯起始，相當于原核生物的SD序列。

將設計合成的pLVX-Mito-OS-Timer表達質粒轉染HEK 293T細胞，在強力霉素（doxycyclin）誘導下，Mito-OS-Timer融合基因表達并靶向線粒體，在激發(fā)光下顯示出綠色熒光，如圖2-B所示。細胞在不同濃度 H2O2（0、10、50、100、200、300 μmol/L）避光處理24 h后，采用倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞熒光情況。線粒體處于氧化應激狀態(tài)時，線粒體內產生大量的ROS，其會加快這種氧化速度，進而加快紅綠熒光轉變速率。在這里使用不同濃度的H2O2使線粒體處于不同強度的氧化應激狀態(tài)，Mito-OSTimer系統(tǒng)可跟蹤監(jiān)測氧化應激強度的變化。如圖2-C、2-D所示，未誘導時，Mito-OS-Timer系統(tǒng)基本以綠色熒光為主，紅綠熒光比值為0.18，隨著H2O2濃度增加紅色熒光強度增加，融合起來的熒光圖變成黃色，H2O2濃度到300 μmol/L時基本上都轉變成紅色熒光，紅綠熒光比值增加到1.52。從上述結果可看出，隨著H2O2濃度的增加Mito-OS-Timer系統(tǒng)紅綠熒光比值增加，Mito-OS-Timer系統(tǒng)成功被構建。

圖2 Mito-OS-Timer系統(tǒng)靶向監(jiān)測H2O2誘導細胞模型的線粒體氧化應激動態(tài)變化Fig.2 Mito-OS-Timer targets to monitor the dynamic changes of mitochondrial oxidative stress induced by H2O2 in cell models

2.1.2 Mito-OS-Timer監(jiān)測魚藤酮誘導細胞模型的線粒體氧化應激動態(tài)變化 雖然H2O2誘導氧化應激細胞建模是常規(guī)方法，但存在一定不穩(wěn)定因素，因此采用其他建模方法進行驗證。魚藤酮是一種線粒體呼吸鏈抑制劑，主要作用于線粒體呼吸鏈NADH脫氫酶處抑制電子的傳遞，阻止NADH的氧化，可促發(fā)線粒體產生氧化應激。本實驗采用不同濃度的魚藤酮（0、0.01、0.1、0.5、1和 5 μmol/L）誘導細胞產生不同強度的線粒體氧化應激。未加魚藤酮時，Mito-OS-Timer系統(tǒng)的綠色熒光很強，紅綠熒光比為0.08，隨著加入魚藤酮濃度的增加，綠色熒光減弱，紅色熒光增加，當達到5 μmol/L時，紅綠熒光比達到0.51（圖3-A、3-B）。

圖3 魚藤酮誘導線粒體氧化應激細胞模型評價Mito-OS-Timer系統(tǒng)Fig.3 Evaluation of Mito-OS-Timer system in rotenone-induced mitochondrial oxidation cell model

為了驗證結果的可靠性，進一步采用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測紅綠熒光比變化情況。未經魚藤酮處理的細胞，其紅綠熒光比值為2.46，而魚藤酮處理后，紅綠熒光比值增加，如圖4-A、4-B所示，魚藤酮處理濃度在0.5-5 μmol/L時的紅綠熒光比增加較緩，但當濃度超過5 μmol/L，由于過度誘導則使得細胞線粒體處于凋亡狀態(tài)，紅色熒光強度反而降低，紅綠熒光比值開始下降。上述結果表明，隨著H2O2和魚藤酮處理濃度的增加，模型細胞內的紅綠熒光比值增加，證實Mito-OS-Timer系統(tǒng)不僅能夠監(jiān)測線粒體的氧化應激狀態(tài)，而且能實現(xiàn)動態(tài)變化的可視化。

圖4 Mito-OS-Timer監(jiān)測魚藤酮誘導線粒體氧化應激細胞模型的流式細胞術檢測結果Fig.4 Flow cytometry results of rotenone-induced mitochondrial oxidation in rotenone-induced cell models monitored by Mito-OS-Timer

2.2 Mito-OS-Timer系統(tǒng)檢測FLCN基因與線粒體氧化應激的信號調控關系

為了進一步驗證Mito-OS-Timer系統(tǒng)檢測線粒體氧化應激的實效性，構建了pLVX-shFLCN重組質粒并進行電泳鑒定，結果見圖5-A、5-B，隨后與pcDNA-3HA-FLCN分別轉染HEK 293T細胞并誘導表達，Western Blot檢測FLCN蛋白表達情況。如圖5-C所示，轉染pcDNA-3HA-FLCN質粒的細胞中FLCN蛋白表達量比對照細胞（WT）中FLCN蛋白表達量明顯增加，轉染pLVX-shFLCN質粒的細胞與對照細胞相比，F(xiàn)LCN表達量明顯減少。上述驗證了FLCN高表達和沉默質粒系統(tǒng)構建成功。隨后，轉染了Mito-OS-Timer的細胞用作陰性對照，使Mito-OS-Timer分別與pLVX-shFLCN、pcDNA-3HAFLCN重組質粒共轉染，利用Dox.誘導表達48 h，將轉染Mito-OS-Timer的細胞用0.1 μmol/L 魚藤酮處理作為陽性對照。經熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測結果可看出，轉染了使FLCN基因過表達的pcDNA-3HA-FLCN重組質粒的細胞，Mito-OS-Timer紅綠熒光強度和紅綠熒光比值與僅轉染Mito-OS-Timer的幾乎一樣，說明FLCN基因過表達并不會使線粒體發(fā)生線粒體氧化應激，而轉染了使FLCN基因沉默的pLVX-shFLCN質粒的細胞，Mito-OS-Timer紅綠熒光強度和紅綠熒光比值明顯增強（圖6-D-F），這表明FLCN基因沉默可促發(fā)細胞線粒體產生氧化應激現(xiàn)象，這與以往報道相符，結果更具有可視化。

圖5 Mito-OS-Timer檢測FLCN基因表達與線粒體氧化應激動態(tài)變化關系Fig.5 Relationship between FLCN gene expression and mitochondrial oxidative stress dynamic changes detected by Mito-OS-Timer

3 討論

本文報道了一種評價氧化應激細胞模型的熒光蛋白實時監(jiān)測系統(tǒng)，即Mito-OS-Timer系統(tǒng)，具有線粒體靶向性和熒光顏色變化與活性氧濃度正相關等特性。實驗結果表明，H2O2誘導和魚藤酮處理的氧化應激細胞模型中，Mito-OS-Timer可借助ATP5PB序列靶向定位線粒體，其紅綠熒光比值與誘導劑濃度呈正相關，證實其可作為評估細胞內線粒體氧化應激程度的可視化工具。為了進一步評價該系統(tǒng)的可行性，利用Mito-OS-Timer檢測并證實FLCN基因表達沉默可誘發(fā)細胞線粒體氧化應激發(fā)生，此結果與以往研究基本一致［18］。

氧化應激（oxidative stress，OS）描述了體內氧化和抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，由德國科學家Helmut Sies首次于1985年提出［19］。隨后，經研究發(fā)現(xiàn)衰老和糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生與之相關而備受關注。近年研究表明，氧化應激是一個由細胞內多種細胞器參與的復雜生化過程，包括線粒體、內質網、高爾基體等。因此，針對各種細胞器建立細胞或動物模型探究相關疾病發(fā)病機理成為了一種研究策略。線粒體氧化應激細胞模型的構建，通常采用H2O2誘導或呼吸鏈抑制劑處理等方法。本研究分別利用H2O2和魚藤酮兩種方法構建了氧化應激細胞模型。H2O2是一種性質相對穩(wěn)定且容易獲得的氧化能力較強的活性氧，是構建細胞氧化損傷常用的誘導劑。魚藤酮有著小而疏水的結構，能夠穿透細胞內部并與NADH脫氫酶相結合，阻斷了電子由NADH向輔酶Q的傳遞。這種電子轉移的抑制干擾了電化學梯度，影響線粒體膜電位，產生的電子不能被正常傳輸，會造成超氧自由基和活性氧的大量積累，最終造成線粒體氧化應激［19］。但也有其他建模方法，例如：Zhang等［20］在非酒精脂肪肝病研究中通過抑制NFκB/Orai1信號通路的方法誘發(fā)氧化應激，即正常大鼠肝細胞（BRL-3A）經NEFA3、BTP2、Orai 1抑制劑處理，分光光度計測量胞內還原谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量，Western Blot和qRT-PCR分析Orai 1等氧化應激相關蛋白表達情況，免疫熒光法檢測活性氧（ROS）水平，以明確氧化應激的發(fā)生。正如上所述，常規(guī)的細胞模型評價方法都是直接或間接檢測氧自由基生成量或氧化應激相關因子的表達情況，但這類靜態(tài)指標的檢測方法，操作過程繁瑣、實驗結果準確性低且費用較高［21］。相較于以往的研究，本研究所提出的Mito-OS-Timer系統(tǒng)能夠在細胞水平對整個氧化應激過程進行實時監(jiān)測，為研究細胞水平氧化應激的發(fā)生提供了一種新的研究思路。

為了驗證Mito-OS-Timer系統(tǒng)的實用性，基于本課題組前期工作設計了一個線粒體氧化應激檢驗模型。人源腫瘤抑制因子Folliculin（簡稱FLCN）的突變或缺失會誘發(fā)Birt-Hogg-Dubé（BHD）綜合征［22］。Baba 等［23］發(fā)現(xiàn) FLCN 基因敲除小鼠腎臟腫瘤細胞中雷帕霉素復合體（the mammalian target of rapamycin，mTOR）信號被激活。mTOR持續(xù)激活可以增強過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1，PGC-1）的基因表達，從而增加線粒體基因表達和氧耗，進而導致線粒體生物發(fā)生和活性氧（ROS）產生加劇，線粒體氧化應激程度加深［22］。Hasumi等［24］發(fā)現(xiàn)FLCN的缺乏促發(fā)PPARGC1A表達上調，導致線粒體功能異常，氧化代謝增強，推測可能是FLCN缺失腎細胞獲得生長優(yōu)勢并驅動增生轉化。這些研究表明，明確FLCN缺失或突變與線粒體氧化應激之間關聯(lián)對于揭示BHD綜合征未知的發(fā)病機制尤為重要。如圖5所示，證實下調FLCN基因表達水平會誘發(fā)線粒體氧化應激發(fā)生，以一種可視化結果證實以往研究的正確性。

本文報道的Mito-OS-Timer系統(tǒng)雖可評價氧化應激細胞模型，但是細胞模型不能準確反應疾病發(fā)生的病理特征，甚至可能獲得較為矛盾的結果，課題組正著手利用該系統(tǒng)構建動物模型評價體系，有望與高度敏感、高通量的生物發(fā)光成像技術相結合，為氧化應激動物模型提供可視化監(jiān)測方法。

4 結論

成功構建了一種靶向監(jiān)測線粒體氧化應激的熒光蛋白系統(tǒng)Mito-OS-Timer。結果表明其紅綠熒光顏色轉變速率與線粒體氧化應激程度呈正相關，實現(xiàn)了對線粒體氧化應激發(fā)生的實時動態(tài)可視化監(jiān)測。研究進一步證實，F(xiàn)LCN基因的沉默能夠引起線粒體氧化應激。該系統(tǒng)在細胞模型上成功應用，但在動物模型上的應用有待進一步研究。