玉米NF-Y轉錄因子基因ZmNF-YB13響應干旱和鹽脅迫的功能分析

張彤彤 鄭登俞 吳忠義 張中保 于榮

（1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048；2.北京市農林科學院生物技術研究所，北京 100097）

玉米（Zea mays L.）適應性強，種植面積廣，是重要的糧食、經濟、飼料作物［1-2］，而干旱［3-5］、鹽堿化［6-8］嚴重影響玉米的生產發展，因此提高玉米對干旱、鹽堿化等非生物脅迫的抗性十分重要。NF-Y家族是一類可以與啟動子序列中的CCAAT-box結合的轉錄因子，又叫亞鐵血紅素激活蛋白（hemeactivator proteins，HAPs） 或 CCAAT結 合 因 子（CCAAT-binding factor，CBF）， 包括 NF-YA（CBFB/HAP2）、NF-YB（CBF-A/HAP3）、NF-YC（CBFC/HAP5）3個亞家族［9］，在植物胚胎和種子發育、脅迫響應等進程中發揮重要作用［10］。在擬南芥、水稻、小麥、油菜、高粱等植物中都有NF-Y家族功能的研究報道。擬南芥NF-YA5基因在干旱脅迫誘導下高表達；和野生型相比，敲除NF-YA5的擬南芥葉片失水更多；相反，過表達NF-YA5的擬南芥植株葉片失水少，抗旱性強［11］。過表達AtNF-YA2、A3、A7和A10的擬南芥植株對干旱等非生物脅迫的耐受性增強［12］。水稻中，Das等［13］報道OsNFYB9在水稻中的異位表達推遲了抽穗期，而且水稻OsNF-YB9能與花發育的關鍵調節因子MADS 1相互作用。在干旱脅迫下，水稻OsNF-YA7表達量上調，過表達OsNF-YA7的水稻抗旱性增強［14］。過表達OsHAP2E的轉基因水稻增強了對鹽堿化和干旱的抗性［15］。小麥中，TaNF-YA10-1基因在擬南芥中異源表達顯著提高了擬南芥對干旱脅迫的耐受性［16］。油菜BnNF-Ys基因家族中的多個基因在鹽、干旱或ABA處理后表達量迅速上調［17］。在鹽、甘露醇、ABA、低溫和高溫不同脅迫下，高粱SbNF-YB7、B12、B15和B16均受較強的誘導表達［18］。除擬南芥、水稻、小麥、油菜和高粱外，茶樹 CsNF-YAs［19］、蘋果 MsNF-YB21［20］和大蒜AsNF-YC8［21］等均在非生物脅迫下誘導表達?？傊?，NF-Y在參與植物耐旱、抗鹽等過程中發揮重要作用，是植物抗逆育種的重要蛋白。

在玉米中，對NF-Y家族的報道還較少。ZmNFYA3能夠分別與bHLH92、FAMA和MYC4的啟動子區結合，提高抗旱性和耐高溫性［22］。玉米ZmNFYC8與擬南芥的NF-YC2基因高度同源，而NF-YC2基因在植物開花過程中起調控作用［23］。我們前期工作發現，ZmNF-YB13（GRMZM5G804893）基因在嚴重干旱脅迫條件下被誘導表達并且表達量較高［24］。本研究從玉米中克隆了ZmNF-YB13基因，在序列分析基礎上分析該基因在玉米不同組織器官以及不同逆境脅迫下的表達模式，并分析該基因異源表達轉基因擬南芥的耐旱、抗鹽表型，以期為耐旱、抗鹽性分子機制解析和分子育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系品種B73用于玉米ZmNF-YB13全長cDNA的克隆及表達模式分析；擬南芥哥倫比亞生態型Col-0用于ZmNF-YB13異源表達載體的轉化；大腸桿菌Trans1 T1購自北京全式金生物技術有限公司；農桿菌GV3101為本實驗室保存；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購于北京擎科生物技術有限公司；過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒等購于北京索萊寶科技有限公司；限制性內切酶等購于寶生物工程（大連）有限公司，常用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆及生物信息學分析

1.2.1.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆 提取玉米葉片總RNA，反轉錄獲得cDNA，設計引物pZmNFYB13-FP、pZmNF-YB13-RP，利用高保真DNA聚合酶對目的基因進行PCR擴增。PCR產物經膠回收后連接至T5 Zero載體，獲得單克隆后送上海生工進行菌落測序。各引物序列見表1。

表1 本實驗所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.1.2 玉米ZmNF-YB13的序列分析及系統發育分析 通過ProParam工具（http://web.expasy.org/protpa ram/）預測ZmNF-YB13基因編碼的蛋白分子量和理論等電點；分別使用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.exp asy.org/）分析蛋白二級結構、空間結構；應用TMH MM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行蛋白跨膜預測分析；使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站進行啟動子區順式作用元件分析。

1.2.2 ZmNF-YB13基因組織差異和脅迫處理表達分析 選取生長在溫室（光照16 h，28℃，黑暗8 h，23℃）中三葉一心時期的玉米幼葉、幼根和莖，選取田間種植的玉米吐絲期穗位葉、根、花絲、雄穗，授粉后10 d的幼胚，-80℃凍存。

將玉米自交系B73幼苗生長于含有營養液的水培桶中，在水培桶中放入通氧石，通過氣泵（45 min通氣/30 min不通氣，間歇循環）給植物提供氧氣。玉米幼苗正常生長至三葉一心時期分別進行脫水、高鹽、冷、PEG、脫落酸（ABA）以及茉莉酸（JA）處理。脫水處理為將幼苗從水培桶中取出，用吸水紙吸收表面多余水分，室溫放置，自然脫水；鹽、PEG處理為將幼苗分別放入含200 mmol/L NaCl和20% PEG的營養液中；冷處理為將含有營養液的幼苗放置在4℃冰箱；分別取處理0、1、2、5、10和24 h后的地上部和根，-80℃凍存。ABA和JA處理分別將含有100 μmol/L ABA和100 μmol/L JA的溶液噴施在幼苗葉片上，并包裹上保鮮膜，分別取處理0、1、2和5 h后的葉，-80℃凍存。

使用凍存的材料提取RNA，逆轉錄后作為qPCR模板。設計特異性引物pZmNF-YB13RT-FP、pZmNF-YB13RT-RP，以GAPDH為內參基因，對不同處理的cDNA進行實時熒光擴增。每組實驗設3個生物學樣本，每個生物學樣本設3個技術重復，數據為3個生物學重復平均值±標準誤差。應用2-ΔΔCT方法分析ZmNF-YB13基因的表達模式。

1.2.3 植物異源表達載體pCAMBIA3301：ZmNFYB13的構建及擬南芥遺傳轉化

1.2.3.1 異源表達載體構建 參照殷龍飛等的方法［25］構建異源表達載體。

1.2.3.2 擬南芥遺傳轉化 將重組質粒pCAMBIA3301∶ZmNF-YB13轉化農桿菌菌株GV3101，通過浸花法侵染擬南芥Col-0，22℃黑暗條件下培養24 h取出擬南芥苗常規培養。單株收取T0代種子，利用含有除草劑草銨膦的培養基進行篩選獲得T1代種子。提取T1代幼苗葉片基因組DNA為模板，利用引物pZmNF-YB13T-FP、pZmNF-YB13T-RP進行PCR檢測。單株收獲陽性植株種子并加代獲得T3代純合植株。

1.2.4 轉基因擬南芥的表型鑒定

1.2.4.1 1/2 MS培養基中不同逆境和激素處理下轉基因擬南芥的表型分析 將異源表達ZmNF-YB13轉基因擬南芥3個株系及野生型擬南芥種子4℃春化3 d后，用0.5% NaClO（有效氯）消毒10 min，接著用無菌蒸餾水清洗5次，然后播種于1/2 MS培養基上。培養7 d后，各株系選取5株生長一致的幼苗移至對照以及分別含100 mmol/L NaCl、200 mmol/L甘露醇、75 μmol/L JA和50 μmol/L ABA 的 1/2 MS培養基上，各設3個重復，垂直放置于22℃，16 h光/8 h暗的溫室中培養，8 d后拍照并使用ImageJ軟件統計根長。

1.2.4.2 土壤中轉基因擬南芥植株的表型分析及生理指標的測定 選取1周大小的發育良好、生長狀態一致的轉基因擬南芥及野生型對照植株移栽至土壤中，分別設置對照組、干旱組、鹽處理組，每組4盒，每盒4株幼苗，各組設3個生物學重復。幼苗在營養土中生長3周后，對干旱組進行3周自然干旱處理和兩天覆水處理；對鹽處理組澆灌300 mmol/L NaCl進行一周脅迫處理。表型觀察后，測定植株的MDA含量和POD的活性。

1.2.5 數據分析 所有試驗均設置3次重復，數據為3個生物學重復平均值±標準誤差。使用生物統計學軟件SPSS 25.0，采用單因素方差對數據進行顯著性分析，不同字母表示在0.05水平上有顯著差異，*表示 0.05 水平上顯著差異，**表示 0.01 水平上極顯著差異。

2 結果

2.1 ZmNF-YB13基因的克隆與生物信息學分析

通過RT-PCR的方法，從玉米中擴增得到ZmNF-YB13基因，全長537 bp，編碼178個氨基酸。對ZmNF-YB13的保守結構域進行分析，發現該基因含有NF-Y家族所特有的保守結構域。生物信息學分析表明，ZmNF-YB13蛋白分子量為18.9 kD，理論等電點為6.83，不具跨膜結構，蛋白二級結構中無規則卷曲所占比例最大（59.93%）。系統進化分析發現，ZmNF-YB13蛋白與水稻中的OsHAP3B親緣關系最近（圖1）。

圖1 ZmNF-YB13基因的系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of gene ZmNF-YB13

利用PlantCARE對ZmNF-YB13基因上游2 000 bp DNA序列進行順式作用元件分析發現，該啟動子含有啟動子核心元件TATA-box、脫水反應相關元件DRE、低溫響應元件LTRE以及光反應響應元件G-box和Box4。此外，還含有ABA激素響應元件ABRE和JA激素響應元件TGACG-motif。

2.2 ZmNF-YB13基因的表達模式分析

2.2.1 玉米ZmNF-YB13基因的組織特異性分析 qPCR分析發現，ZmNF-YB13基因在不同組織中均有表達。在花絲中的表達量最高，在成熟根、莖、雄穗、幼根和幼胚里的表達量較低，在穗位葉和幼葉里的表達量最低（圖2）。

圖2 ZmNF-YB13基因在玉米不同組織中的差異表達分析Fig.2 Tissue-specific expression pattern of gene ZmNFYB13 in maize

2.2.2 玉米ZmNF-YB13基因的誘導表達分析 通過qPCR對ZmNF-YB13在不同逆境處理下的表達模式進行了分析。脫水處理下，地上部ZmNF-YB13的表達量先下調后上調，在10 h達到峰值，與對照組相比顯著上升；根中ZmNF-YB13的表達量逐漸上調，在10 h出現下調，隨后在24 h時上調并達到峰值，約為對照的2.3倍（圖3-A）。冷（4℃）處理下，ZmNF-YB13在地上部中表達量下調；在根中先下調后上調，在5 h時表達量最大，與對照組差異顯著（圖3-B）。鹽處理下，地上部中的表達量在24 h時顯著上調；在根中表達量迅速上調，并在24 h達到最高水平，約為對照的32倍（圖3-C）。PEG處理下，ZmNF-YB13在地上部中的表達量迅速上調，隨后下調，但在24 h達到最高，顯著高于對照水平；在根中呈現先下調后上調的趨勢，在5 h表達量顯著低于對照組，在24 h時表達量最高（圖3-D）。在噴施植物激素ABA后，ZmNF-YB13在葉中的表達量迅速下調，在3 h時出現上調，表達水平最高（圖3-E）。在JA處理下，ZmNF-YB13在葉中的表達量緩慢上調，在5 h時達到最高水平，約為對照的2.3倍，差異顯著（圖3-F）。

圖3 逆境和激素脅迫下ZmNF-YB13基因的表達模式分析Fig.3 Expressions of ZmNF-YB13 in response to abiotic and hormone stress in maize

2.3 ZmNF-YB13轉基因擬南芥的抗逆性分析

2.3.1 ZmNF-YB13轉基因植株的獲得 提取具有草銨膦抗性的擬南芥植株DNA，進行PCR檢測，發現在6個獨立的轉基因株系中檢測到目的基因的存在，而野生型和陰性對照均無相應的擴增產物（圖4-A）。通過qPCR檢測發現，ZmNF-YB13基因在6個轉基因株系中均有不同程度的表達，表達水平顯著高于野生型對照植株（圖4-B）。選取L-1、L-2和L-3三個株系進行后續表型觀察與鑒定。

圖4 T3代轉基因擬南芥的鑒定Fig.4 Identification of T3 transgenic A.thaliana

2.3.2 1 /2 MS培養基中不同逆境和激素脅迫下轉基因擬南芥的表型分析 由圖5可知，在對照組1/2 MS培養基中，野生型和轉基因擬南芥均能正常生長。在含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養基中，野生型和轉基因擬南芥葉片萎縮，轉基因擬南芥中L-2和L-3根長與野生型擬南芥無顯著差異，但L-1的根長長于野生型，差異顯著（P ＜ 0.05）。在含有200 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養基中，轉基因擬南芥根長長于野生型，差異極顯著（P ＜ 0.01）。在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培養基中，野生型和轉基因擬南芥側根較少，但轉基因擬南芥根長長于野生型，差異顯著（P ＜ 0.05）。在含有50 μmol/L ABA的1/2 MS培養基中，野生型和轉基因擬南芥葉片均發黃，但轉基因擬南芥根長長于野生型，差異極顯著（P ＜0.01）。以上結果說明，異源表達ZmNF-YB13使擬南芥對逆境以及激素脅迫的耐受性增強。

圖5 不同脅迫處理下轉ZmNF-YB13基因擬南芥的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of ZmNF-YB13 transgenic A.thaliana under different stress treatments

2.3.3 土壤種植條件下轉基因擬南芥株系的耐旱和抗鹽性分析 在正常培養條件下，野生型和轉基因擬南芥生長良好，無表型差異（圖6-A）。對轉基因株系和野生型植株進行連續3周的干旱脅迫和一周高鹽（300 mmol/L NaCl）脅迫處理，發現野生型植株葉片嚴重萎蔫失水，而轉基因植株含有更多的綠葉（圖6-B，C），表現出更健康的生長狀態。干旱處理實驗組，經過2 d的覆水處理后，野生型擬南芥葉片出現輕微的恢復，而過表達植株的葉片充分伸展，呈健康的狀態。分別對鹽和干旱處理的野生型和轉基因擬南芥葉片的MDA含量和POD活性進行檢測，結果（圖6-D）表明，兩種處理條件下，ZmNF-YB13異源表達擬南芥的MDA含量均低于野生型，差異極顯著。在干旱處理下，轉基因擬南芥的POD活性顯著高于野生型。而在正常處理和鹽處理下，POD的活性在野生型和轉基因擬南芥中均無明顯差異（圖6-E）。

圖6 土壤中高鹽和干旱處理下擬南芥表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of A.thaliana under high salt and drought treatment in soil

3 討論

植物對高鹽、干旱脅迫的響應機制是一個非常復雜的過程，轉錄因子在調節植物發育過程和響應環境變化中起著重要作用［26］。植物的NF-YB基因家族的不同成員參與了植物對干旱、鹽等逆境脅迫的響應［27］。本研究從玉米中克隆了一個NF-YB轉錄因子基因ZmNF-YB13，具有NF-Y轉錄因子家族所特有的結構域。

目前其它物種中有許多NF-YB亞家族在響應植物脅迫中的報道。如分別過表達AtNF-YB1和AtNFYB2的擬南芥植株抗旱性和耐熱性增強［28］。在干旱脅迫條件下，ZmNF-YB16的過表達提高了玉米植株在營養和生殖階段對脫水和干旱脅迫的抗性，并提高了玉米產量［29］。異源表達野云杉PwNF-YB3基因的擬南芥植株對鹽、干旱和滲透脅迫的耐受性顯著增強［30］。在缺水條件下，異源表達葡萄PdNF-YB7基因的擬南芥植株表現出更強的耐旱性［31］。在菊花中過表達CmNF-YB8基因降低了植株的耐旱性。而通過RNA干擾降低CmNF-YB8基因的轉錄水平后，植株的抗旱性增強［32］。這些研究結果表明，不同物種中的NF-YB轉錄因子對不同逆境的響應存在差異。本研究發現ZmNF-YB13基因受脫水、冷、高鹽、PEG脅迫的誘導表達，說明ZmNF-YB13基因能夠響應非生物脅迫。為進一步明確該基因在響應玉米非生物脅迫中的作用，我們對轉ZmNF-YB13基因擬南芥進行了抗逆分析。結果發現，在分別含有100 mmol/L NaCl和200 mmol/L 甘露醇的1/2 MS培養基中，轉基因擬南芥根長長于野生型，差異顯著。土壤中生長的轉基因擬南芥，在干旱和含有300 mmol/L NaCl的高鹽處理下，綠葉數量更多，差異顯著。MDA是一種脂質過氧化產物，通過測量MDA的含量可以評估植株氧化應激反應［33］。結果顯示，在干旱和高鹽處理下轉基因擬南芥中MDA含量低于野生型，差異顯著。并且在干旱脅迫下，轉基因擬南芥的POD活性顯著高于野生型，進一步說

明了ZmNF-YB13基因參與植物的干旱和鹽脅迫響應過程。

本實驗研究的ZmNF-YB13基因，曾被命名為ZmNF-YB2，前人研究發現轉ZmNF-YB2基因玉米可以增強玉米的抗旱性［34］。我們的研究結果顯示，異源表達ZmNF-YB13基因的轉基因擬南芥抗旱性增強，這和前人研究結果一致。同時我們還發現了ZmNF-YB13基因能夠響應鹽脅迫。通過qPCR發現ZmNF-YB13基因的表達量在JA處理下上調表達。并且在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培養基中，異源表達ZmNF-YB13基因的擬南芥根長顯著長于野生型。由此推測，ZmNF-YB13基因可能是通過JA信號通路來參與干旱和高鹽的脅迫應答。

4 結論

玉米NF-Y家族基因ZmNF-YB13 cDNA全長537 bp，編碼173個氨基酸。該基因在玉米多個組織器官中均有表達，其中在花絲中表達量最高，受脫水、冷、高鹽、PEG逆境處理以及ABA、JA激素脅迫的誘導表達；轉基因擬南芥根長在含100 mmol NaCl、200 mmol甘 露 醇、75 μmol/L JA、50 μmol/L ABA的1/2 MS培養基中與野生型有顯著差異；在干旱和高鹽處理下，土壤中生長的轉基因植株的MDA含量降低；同時干旱處理下，轉基因植株的POD活性升高，差異顯著，推測ZmNF-YB13基因在玉米響應干旱和高鹽脅迫中起重要作用。