程序性壞死在骨科相關疾病發生發展中的作用研究進展

蘇天，溫鵬，黎祥濤，崔紅旺

海南醫學院第一附屬醫院脊柱外科，海口 570102

一直以來細胞被認為只有兩種基本死亡模式，即凋亡和壞死。凋亡是受到機體調控的主動性死亡，而壞死則是不受機體調控的被動性死亡。然而相關學者研究發現，細胞壞死中也存在可調控的死亡方式，即程序性壞死［1］。程序性壞死屬于半胱天冬酶非依賴性的一種死亡方式，目前受體相關蛋白激酶（RIPK）1和RIPK3是已知程序性壞死中起重要作用的細胞內信號蛋白，混合譜系激酶配體（MLKL）作為RIPK1 和RIPK3 的下游分子，是程序性壞死的關鍵效應因子［2］。腫瘤壞死因子α（TNFα）、γ 干擾素（IFN-γ）、內毒素和FasL 等炎癥因子可以觸發程序性壞死，并通過TNFR1、IFNR、TLR3/4和Fas/TRAILR 傳遞信號，引起程序性壞死信號發生級聯反應［3］。在這些炎癥因子中，TNF-α/TNFR1驅動的信號級聯反應是目前研究的熱點，當TNF-α激活TNFR1 發生級聯反應后，細胞內可形成不同的復合物，分別是復合物Ⅰ、復合物Ⅱa 和復合物Ⅱb，復合物Ⅱb 介導發生程序性壞死，使細胞膜完整性破壞并執行細胞死亡［4］。越來越多的證據表明，多種炎癥、心血管和神經相關疾病的發生、發展和預后過程中皆涉及到了程序性壞死［5］。而程序性壞死在骨科相關疾病中的作用也越來越受到關注。本文就程序性壞死在不同骨科相關疾病［骨質疏松、椎間盤退行性變（IVDD）、脊髓損傷（SCI）、骨關節炎（OA）］中的作用作一綜述，為今后骨科相關疾病的防治提供新的思路。

1 程序性壞死與骨質疏松的發生發展

隨著老齡化的加劇，我國骨質疏松發病率逐年升高。據統計，2018年我國65歲以上人群骨質疏松發病率已達32.0%［6］，而我國第七次全國人口普查數據分析結果顯示，我國將會在2022 年—2035 年、2041 年—2053 年迎來第二波、第三波老齡化［7］。老齡伴發的骨質疏松常常引發脆性骨折，據預測30年后我國因骨質疏松引起的骨折人數將近600 萬，相應的醫療費用可高達1 745 億元［8］。因此，骨質疏松發病率、病殘率和醫療成本的增加已經成為我國一個日益嚴重的健康問題，使得骨質疏松發病機制和治療方法的研究成為了當前的熱點和難點，其中研究比較廣泛的就是程序性壞死。

1.1 骨細胞程序性壞死 既往研究認為，骨細胞凋亡是骨質疏松發生發展過程中惟一的死亡方式，但近幾年研究發現，骨細胞程序性壞死也參與了骨質疏松的發生發展。CUI 等［9］將大鼠卵巢切除（OVX）后構建雌激素缺乏性骨質疏松模型，發現大鼠卵巢切除后8 周骨組織中有大量骨細胞TUNEL 陽性，但Caspase-3 陰性；后續進一步研究發現，骨細胞內RIPK1 和RIPK3 表達均顯著升高，同時透射電鏡也觀察到典型壞死形態學的骨細胞，表明骨細胞的程序性壞死參與了OVX大鼠骨質疏松的發生過程。

1.2 成骨細胞程序性壞死 鐵是人體必需的微量元素之一，其在DNA 合成、能量代謝和氧氣運輸等生物過程中發揮至關重要的作用。但是鐵在人體衰老過程中會逐漸積累，過量鐵會加速絕經后女性和老年男性的骨質流失［10］。既往研究發現，鐵超載引起的氧化應激是骨質疏松發病的主要機制之一［11］。為證實程序性壞死是否參與鐵超載引起的骨質疏松，TIAN 等［12］在體外研究了程序性壞死與鐵超載誘導成骨細胞死亡之間的潛在機制，結果發現程序性壞死參與了鐵超載誘導的成骨細胞死亡，其中活性氧（ROS）在鐵超載誘導的成骨細胞程序性壞死中起重要的調節作用。

1.3 破骨細胞程序性壞死 除了骨細胞和成骨細胞之外，破骨細胞程序性壞死也被發現參與了骨質疏松的發生發展。MULLIN 等［13］為了明確骨質疏松中發揮關鍵作用的相關基因，將骨密度—全基因組關聯研究的結果與破骨細胞表達數量性狀位點（eQTL）的數據集相結合，結果發現缺乏程序性壞死小鼠表現出破骨細胞數量增加和骨微結構紊亂，進而調控骨質疏松相關的RIPK3基因遺傳效應。以上程序性壞死的研究結果為今后預防和治療骨質疏松提供了新策略。

2 程序性壞死與IVDD的發生發展

IVDD是一種隨著機體衰老，椎間盤逐漸發生變性的病理性改變，最終常常誘發嚴重的腰背和神經根性疼痛等相關癥狀。據統計，50%～80%的成年人一生中會出現腰背痛癥狀，嚴重的腰背疼痛可以直接影響人們的生活質量和工作能力［14］。相關調查也發現，全球范圍內約有5.4 億人因腰背痛而長期喪失活動能力［15］。既往研究表明，椎間盤退行性變的一個主要特征是髓核（NP）細胞數量下降，NP 細胞數量下降和許多因素相關，包括生物力學、炎癥因子、氧化應激、自噬和凋亡等，近年來研究發現程序性壞死也參與了椎間盤退行性變。

2.1 生物力學改變影響程序性壞死 研究表明，在人類胎兒發育期間具有壞死形態特征的NP 細胞占總NP 細胞的比例不到2%，然而在椎間盤退行性變的成人和老年人中這一比例為50%～80%［16］。這提示我們，NP細胞壞死可能是由機體精確調節的。除此之外，有研究表明，受壓力暴露的NP 細胞會發生凋亡和自噬，但抑制NP細胞凋亡和自噬信號通路后也無法有效阻止NP細胞死亡［17］。因此，有相關學者推測NP細胞的壞死可能存在其他形式，如程序性壞死。CHEN 等［18］研究顯示，機械壓力可導致NP 細胞pRIPK1 和pRIPK3 大量激活，呈現時間依賴性的壞死形態改變，表現為細胞活力降低、細胞死亡率增加，電鏡下NP 細胞出現嚴重的空泡化、大量線粒體損傷和質膜破壞，而使用RIPK1、RIPK3、MLKL 特異性抑制劑可顯著降低機械壓力引起的壞死形態學變化以及細胞死亡率，提示機械壓力誘導后的大鼠NP細胞死亡與程序性壞死相關。

2.2 氧化應激影響程序性壞死 為了研究氧化應激條件下，程序性壞死是否參與了大鼠椎間盤NP細胞的死亡，ZHAO 等［19］將鼠NP 細胞置于不同濃度的H2O2下，觀察其細胞活力、細胞死亡率、RIPK1、RIPK3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）和凋亡誘導因子（AIF），并使用RIPK1 抑制劑Necrostatin-1（Nec-1）、PARP 抑制劑二苯基苯醌和小干擾RNA 間接評估程序性壞死；結果表明，在氧化應激下RIPK1/RIPK3 介導的程序性壞死可通過PARP/AIF途徑在NP細胞死亡中發揮重要作用。ZHANG 等［20］研究發現，在人嚴重退變椎間盤組織中Caspase-3/8、RIPK1、RIPK3 和MLKL 表達均顯著升高；該研究從人NP 組織中分離NP 細胞，通過白細胞介素1β（IL-1β）誘導建立NP 細胞體外退變模型，結果發現模型NP 細胞中Caspase-3/8、RIPK1、RIPK3和MLKL表達均顯著升高，而使用MLKL 抑制劑Necrosulfonamide（NSA）可逆轉IL-1β 的上述作用；同時NSA 可顯著抑制基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-10、IL-6和TNF-α 等炎癥因子表達，促進椎間盤組織中抗氧化劑SOD1、SOD2、CAT 和GPX3 表達［20］。因此，NSA可能通過抑制NP細胞凋亡和程序性壞死來阻止NP降解，而拮抗細胞死亡的保護作用可能與其抑制炎癥和氧化應激反應有關。

3 程序性壞死與SCI的發生發展

SCI 可導致損傷節段以下出現嚴重的功能障礙，是青壯年致殘的主要原因之一［21］。SCI 包括原發性和繼發性兩個過程，原發性SCI 病因為脊髓的直接機械損傷，直接機械損傷導致有毒化學物質、細胞因子和自由基復合體的產生，進而引發繼發性SCI 的發生。SCI 損傷過程的病理機制較為復雜，其中神經細胞死亡是核心環節。目前神經細胞的死亡主要包括壞死、凋亡和程序性壞死［22］。

在程序性壞死方面。KANNO 等［23］發現，SCI 動物模型脊髓半切后損傷部位RIPK3的表達增加始于24 h，3 d 后顯著升高并達到高峰。除此之外，在使用碘化丙啶（PI）標記脊髓切片的RIPK3 免疫染色中，損傷側發現PI 標記和RIPK3 陽性表達的細胞數量增多，并且PI 標記細胞通常為RIPK3 陽性，在高倍鏡下觀察PI 標記、RIPK3 陽性的細胞中大多數細胞核是壞死形態；除了RIPK3陽性之外，損傷脊髓組織中神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞中也可以觀察到RIPK1 的表達，且RIPK1 陽性率高于TUNEL 陽性率［24］。這些結果表明，程序性壞死參與了SCI的病理過程。

由于SCI 的損傷機制較為復雜，因此目前針對SCI 的有效治療方法還在深入研究。近年來，隨著程序性壞死信號靶點的不斷研究，國內外學者逐漸發現程序性壞死關鍵節點RIPK1、RIPK3 和MLKL抑制劑對SCI 有潛在的治療作用。在RIPK1 抑制劑方面，與二甲基亞砜處理的小鼠相比，Nec-1 處理的小鼠脊髓損傷后24 h 的PI 陽性細胞數量減少，組織損傷減輕，存活神經元數量增多，并且從第7天到第14 天小鼠的脊髓功能逐漸得到恢復［25］。還有研究發現，Nec-1 可抑制線粒體中細胞色素c 釋放，減輕線粒體腫脹［26］；同時Nec-1可減少SCI后內質網和線粒體的超微結構損傷，并抑制內質網應激相關基因和蛋白表達［27］。在MLKL 抑制劑NSA 方面，NSA 可以防止線粒體膜電位、三磷酸腺苷、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平降低，抑制活性氧和丙二醛水平升高，同時減輕脊髓神經元損傷和改善SCI 小鼠的運動功能［28］。以上結果表明，阻斷程序性壞死信號通路有望在一定程度上阻止SCI的發生、發展。

4 程序性壞死與OA的發生發展

OA是臨床骨科常見病和多發病，伴有關節軟骨退變和滑膜炎癥等病理改變，表現為關節疼痛和僵硬，嚴重影響患者的健康和日常生活。據相關流行病學調查顯示，我國大于65 歲人群OA 整體發病率為8.1%，且伴隨著人口老齡化和壽命的延長，OA患病人數將不斷增加［29］。當前OA 的發病機制除了與MMP、細胞因子和免疫反應等方面有關外，細胞的死亡方式也逐漸被深入研究。研究發現，OA患者和OA 小鼠軟骨組織中存在程序性壞死標志物RIPK3、MLKL 和p-MLKL 表達，證明程序性壞死參與了人和小鼠OA 的發生過程［30］。CHENG 等［31］在人OA 軟骨樣本中觀察到典型的壞死細胞形態，并發現OA 患者和OA 模型大鼠的軟骨中RIPK1 表達顯著上調；進一步研究發現，OA模型大鼠的關節內RIPK1過表達，使軟骨細胞發生了程序性壞死，并破壞細胞外基質代謝穩態，導致大鼠軟骨的結構和功能受損；該研究在使用Nec-1 抑制RIPK1 活性后，發現大鼠軟骨的結構和功能得到了一定的保護；除此之外，還發現骨形態發生蛋白7（BMP-7）是軟骨細胞程序性壞死的一個下游靶點，RIPK1/BMP7 通路的激活可以進一步促進軟骨細胞發生程序性壞死，致使OA 的發生。

綜上所述，人體細胞死亡一直以來都是疾病發生、發展的核心環節，機體正常生長、發育的關鍵在于細胞增殖和死亡之間的平衡。程序性壞死被認為是一種可調控的細胞死亡方式，關于其信號通路以及關鍵信號分子的研究越來越深入透徹，其調控環節中的一些小分子化合物RIPK1、RIPK3 和MLKL有可能成為治療骨科相關疾病的潛在藥物。但程序性壞死是一個極其復雜的過程，通路內信號分子之間相互作用、錯綜復雜，下游信號通路更是一片未知的領域，因此仍需要我們不斷地深入研究和探索。