芳樟微扦插生根過程中相關(guān)氧化酶活性和碳水化合物的變化

肖祖飛，盛盼進(jìn)，徐藝鳳，彭 藝，姜 睿，鄭寶健，李 鳳

（南昌工程學(xué)院江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心，江西南昌 330099）

樟樹（Cinnamomum camphora）又名香樟，主要分布于長江以南地區(qū)，以臺灣、江西、湖南等地最多[1].根據(jù)枝葉精油主成分含量，可將樟樹分為芳樟醇型、樟腦型、龍腦型等類型，例如主含芳樟醇的樟樹稱為芳樟（Cinnamomum camphoract.linalool）.天然芳樟醇具有“香料之王”的美稱，在食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有較高經(jīng)濟(jì)價值[2-4].扦插繁殖是植物繁殖的重要方式，有研究表明，美國薄荷扦插初期，插穗脫離母體，由于克服各種逆境脅迫，超氧化物歧化酶活性（SOD）會迅速上升，不定根形成后，SOD活性緩慢下降[5].在‘香妃’含笑扦插前期，過氧化物酶活性（POD）能有效清除植物體內(nèi)過多的吲哚乙酸（IAA），有利于誘導(dǎo)愈傷組織和根原基的形成[6].ABT生根粉處理納塔櫟插穗，多酚氧化酶活性（PPO）在插穗生根各個階段均高于對照組，表明高活性PPO有利于插穗愈傷組織和不定根形成[7].垂珠花硬枝扦插生根結(jié)果表明，扦插前期，吲哚乙酸氧化酶活性（IAAO）較低，有利于植物內(nèi)源IAA積累，利于插穗根原基發(fā)生[8].芳樟苗木的扦插繁殖技術(shù)雖較成熟，但關(guān)于樟樹扦插生根過程生理生化的變化尚未見報道.因此，本文借鑒上述研究方法，研究3000 mg/L吲哚丁酸（IBA）處理下芳樟微扦插生根過程SOD、POD、PPO、IAAO活性，觀察可溶性糖和淀粉含量的變化趨勢，以期為芳樟微扦插繁殖生根機(jī)理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試母樹為20年生芳樟，胸徑30 cm、樹高12 m、南北冠幅8 m.

1.2 試驗設(shè)計

在5月份剪取樹冠當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，修剪成一葉一芽莖段（5 cm～6 cm）進(jìn)行微扦插.扦插基質(zhì)采用紅壤土和草木灰混合基質(zhì)（v:v=4:1），插穗基部用3000 mg/L IBA速蘸30 s.扦插后每周隨機(jī)抽查插條的變化情況，尤其注意基部的形態(tài)變化并做好記錄和拍照.扦插0 d、3 d、7 d、14 d、28 d、35 d和42 d取樣用于SOD、POD、PPO、IAAO活性，可溶性糖和淀粉含量的測定，取樣樣品為插穗基部（1.0～1.5）cm莖段的韌皮部，3次生物重復(fù).扦插60 d時統(tǒng)計生根情況，包括生根率（產(chǎn)生不定根的插條株數(shù)占總插條數(shù)的百分比）、不定根數(shù)量（插條產(chǎn)生不定根的平均數(shù)）和不定根根長（插條產(chǎn)生不定根的平均根長）.

1.3 指標(biāo)測定方法

SOD活性的測定采用NBT光照化學(xué)還原法、PPO活性的測定采用鄰苯二酚比色法，可溶性糖和淀粉含量測定采用蒽酮比色法[9]，POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[10]，IAAO活性的測定采用二氯酚比色法[11].

1.4 扦插后管理

采用塑料薄膜拱篷保持插床內(nèi)濕度（80%以上）和溫度（夜間15℃～20℃，白天25℃～30℃）.扦插圃周圍和上方搭建遮陽網(wǎng)（遮光度70%），遮陽網(wǎng)高度為3 m左右.扦插后每周用0.1%多菌靈溶液對插穗進(jìn)行消毒，及時清除枯枝爛葉，保持插床干凈整潔，扦插基質(zhì)處于濕潤狀態(tài)，即以手握基質(zhì)能成團(tuán)，松手后輕輕抖動能散開為好.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與方法

數(shù)據(jù)用Excel2011進(jìn)行整理、計算和方差分析，顯著性水平為0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 芳樟微扦插生根過程插穗基部形態(tài)變化

通過外部形態(tài)觀察（圖1），芳樟微扦插（1～14）d，插穗基部外部變化不明顯；扦插21 d時，插穗基部切口開始愈合，插穗基部膨大、形成少量的愈傷組織；扦插28 d時，插穗基部愈傷組織增大增多，插穗基部切口愈合；扦插35 d時，插穗基部有不定根出現(xiàn)，插穗開始生根；扦插42 d時，不定根根數(shù)增多、增長、變粗，部分插穗不定根有須根.扦插60 d，統(tǒng)計插穗生根率為67.67%、平均根數(shù)3.27、平均根長3.89 cm、平均根粗1.04 mm.

圖1 3000 mg/L IBA處理芳樟微扦插生根過程插穗基部形態(tài)變化

2.2 芳樟微扦插生根過程SOD和POD活性變化

由圖2可知，芳樟微扦插生根過程SOD活性呈“先升后降”變化趨勢.扦插（0～28）d，SOD活性持續(xù)升高，在扦插28 d時SOD活性達(dá)到峰值(345.42/(U/g·min))，顯著高于其它扦插天數(shù)，其中扦插（7～14）d和（21～28）d SOD活性上升速度最快.與扦插0 d、7 d、14 d、21 d相比較，扦插28 d時SOD活性分別增加了253.41%、121.84%、34.80%和25.14%.扦插28 d后，SOD活性緩慢下降.與扦插28 d相比較，扦插35 d和42 d SOD活性分別下降了14.65%和22.54%.與扦插0 d相比較，扦插35 d和42 d SOD活性還處于一個較高的水平，分別高了201.63%和173.76%.

圖2 芳樟微扦插生根過程SOD活性的變化

由圖3可知，芳樟微扦插生根過程POD活性呈“升-降-升-降”變化趨勢.扦插（0～14）d時，POD活性迅速上升，扦插（14～21）d時，POD活性下降，扦插（21～28）d時，POD活性上升，扦插28 d時達(dá)到峰值( 111.59 U/g·min)，顯著高于其它扦插天數(shù).扦插28 d后，POD活性下降，與扦插28 d相比較，扦插35 d和42 d時POD活性分別下降了23.28%和25.60%；與扦插0 d比較，扦插35 d和42 d時POD活性還比較高.

圖3 芳樟微扦插生根過程POD活性的變化

2.3 芳樟微扦插生根過程PPO的變化

由圖4可知，芳樟微扦插生根過程PPO活性變化趨勢與SOD活性相似.扦插（0～21）d，PPO活性持續(xù)上升，在扦插21 d時PPO活性達(dá)到峰值(207.13 U/g·min)，顯著高于其它扦插天數(shù).與扦插0 d、7 d、14 d相比較，扦插21 d時PPO活性分別上升了338.56%、94.38%、56.04%.扦插21 d后，PPO活性下降，與扦插21 d相比較，扦插28 d、35 d、42 d時PPO活性分別下降了10.16%、29.97%、35.31%.

圖4 芳樟微扦插生根過程PPO活性的變化

2.4 芳樟微扦插生根過程IAAO的變化

由圖5可知，芳樟微扦插生根過程中IAAO活性呈“先降后升”變化趨勢.扦插（0～21）d，IAAO活性不斷下降，在扦插21 d時降至最低值(89.12 U/g·min)，其中扦插（0～14）d下降較為緩慢，（14～21）d下降較快.與扦插0 d、7 d、14 d相比較，扦插21 d IAAO活性分別下降了51.24%、46.59%、43.97%.扦插（21～42）d，IAAO活性逐漸上升，上升趨勢較緩慢，與扦插21 d相比較，扦插28 d、35 d、42 d IAAO活 性 分 別 上 升 了43.78%、59.94%、62.74%.

圖5 芳樟微扦插生根過程IAAO活性的變化

2.5 芳樟微扦插生根過程可溶性糖和淀粉的變化

由圖6可知，扦插（0～28）d，芳樟插穗內(nèi)可溶性糖含量隨扦插天數(shù)增加而升高，扦插28 d后可溶性糖含量無顯著變化.扦插35 d時可溶性糖含量達(dá)到最大（11.58 mg/g），顯著高于扦插（0～21）d階段可溶性糖的含量，與扦插28 d、42 d時差異不顯著.與扦插0 d、7 d、14 d相比較，扦插35 d時可溶性糖含量分別增加226.20%、163.78%、32.65%.

圖6 芳樟微扦插生根過程可溶性糖含量的變化

由圖7可知，扦插（0～14）d，芳樟插穗內(nèi)淀粉含量逐漸降低.扦插14 d時，淀粉含量降到最低（13.76 mg/g），與扦插0 d、7 d相比較，分別下降了35.16%、28.30%.扦插14 d后，淀粉含量稍有增加.

圖7 芳樟微扦插生根過程淀粉含量的變化

3 討論與結(jié)論

3.1 芳樟微扦插生根與SOD、POD的變化關(guān)系

在植物保護(hù)系統(tǒng)中，SOD作為第一道防線，可以清除植物體內(nèi)有害自由基，起到自我保護(hù)作用.本試驗中，SOD活性整體呈“先升后降”趨勢，這與姜宗慶等[12]對銀杏嫩枝扦插、王磊等[13]對鐵線蓮扦插生根研究結(jié)果一致.扦插（1～28）d，插穗離開母樹，切口裸露且內(nèi)部處于失水逆境狀態(tài)，為了減少自由基對植物細(xì)胞的傷害，SOD活性升高.扦插28 d以后，隨有插穗切口的愈合、愈傷組織、根源基及不定根的形成，插穗可以進(jìn)行正常新陳代謝，體內(nèi)多余自由基被清除，SOD活性逐漸下降.

POD廣泛分布于植物體內(nèi)的，影響著植物體內(nèi)多種生理生化過程，在植物的生長發(fā)育中起重要作用.本試驗研究發(fā)現(xiàn)，扦插（0～14）d，插穗基部無明顯變化，插穗內(nèi)部POD活性迅速上升；扦插（14～21）d插穗切口開始愈合，基部愈傷組織開始形成，POD活性下降；扦插（21～28）d，插穗基部切口愈合，愈傷組織面積增大，POD活性大幅度上升，且于扦插28 d達(dá)到峰值.有研究表明，合歡硬枝扦插后20 d，POD活性上升，氧化插條內(nèi)部過多IAA，誘導(dǎo)根源基形成，隨后POD活性下降，內(nèi)源IAA上升，有利于不定根的表達(dá)，之后POD活性又上升，促進(jìn)不定根的生長[14].在刺槐嫩枝扦插生根過程中，POD活性低有利于誘導(dǎo)愈傷組織形成[15].扦插28 d后，不定根突出表皮，POD活性下降，但仍維持較高水平，這可能是有利于根的伸長和木質(zhì)化[16].植物扦插繁殖生根過程中POD活性會出現(xiàn)兩個峰值[17]，與本試驗結(jié)果較為一致.

3.2 芳樟微扦插生根與PPO的變化關(guān)系

在扦插生根過程中，PPO催化酚類物質(zhì)與IAA形成一種生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”，能夠促進(jìn)不定根形成.本試驗中，PPO活性整體趨勢呈現(xiàn)出“先升后降”趨勢.扦插（1～21）d，PPO活性升高，可能有利于插穗基部切口的愈合，誘導(dǎo)愈傷組織和根原基的形成；扦插21 d后，隨著插穗不定根的表達(dá)，PPO活性下降，可能有利于不定根及側(cè)根的生長.有研究表明，PPO活性在榛子插穗愈傷組織形成期和根原基誘導(dǎo)期上升，不定根表達(dá)期下降[18].此外，SOD活性在扦插后28 d達(dá)到峰值，而PPO活性在扦插后21 d達(dá)到峰值，PPO活性峰值在SOD之前，這與韋冬山[5]等人研究結(jié)果一致.

3.3 芳樟微扦插生根與IAAO的變化關(guān)系

IAAO可以調(diào)節(jié)插穗內(nèi)源IAA含量，影響插穗生根.本試驗中，扦插（0～21）d，大多插穗基部切口愈合，愈傷組織開始形成，IAAO活性下降，低活性IAAO能促使插穗體內(nèi)IAA的合成，有利于誘導(dǎo)愈傷組織和根原基的形成；扦插21 d后，IAAO活性上升，IAA含量下降，有利于不定根的發(fā)生和生長[19].值得注意的是，IAAO和POD都能通過調(diào)節(jié)插穗內(nèi)源IAA含量從而影響插穗的生根，但I(xiàn)AAO是降解IAA專一性酶，而POD是參與IAA的分解.

3.4 芳樟微扦插生根與可溶性糖、淀粉的變化關(guān)系

營養(yǎng)物質(zhì)對插穗生根起著重要的作用.在扦插初期，插穗主要利用自身儲存的淀粉、可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)維持代謝需求[20].本試驗中，扦插（0～14）d，插穗內(nèi)淀粉含量迅速下降，之后淀粉含量逐漸升高；而可溶性糖在扦插（0～28）d迅速上升，之后基本保持不變.扦插前期，淀粉被水解成可溶性糖，為愈傷組織和根原基的形成提供能量，隨著根原基及不定根的形成，插穗具備完整植株的功能，根系能夠吸收水分和養(yǎng)分，新生葉片發(fā)生，光合作用增強(qiáng)，淀粉開始積累，因此淀粉含量逐漸上升，可溶性糖基本保持不變.