不同還原糖糖基化對超聲波預處理α-乳白蛋白結構和抗氧化活性的影響

卜 單，涂宗財,2,3，劉光憲，胡月明，王 輝,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學 國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌 330022；3.江西師范大學 江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022；4.江西省農業科學院，江西 南昌 330299）

牛α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）由123 個氨基酸殘基組成，分子質量約為14.2 kDa。二級結構中α-螺旋結構相對含量為26%，β-折疊結構相對含量為14%[1]。牛乳α-LA占總蛋白的5%，能夠調節機體中乳糖合成，含有大量的必需氨基酸（63.2%），牛乳α-LA 74%的氨基酸序列與母乳的α-LA相同，且有6%的殘基化學性質類似[2]，因而牛乳α-LA是一種適合作為嬰兒食品營養成分的蛋白質。

據報道，糖基化反應和超聲波處理能夠調節α-LA的功能。糖基化反應主要通過還原糖與氨基或脂質氧化產物的相互作用，與化學修飾和酶修飾相比，是一種安全的蛋白修飾方法。美拉德反應可增強魚鱗明膠的抗氧化活性[3]；Wang Xumei等[4-5]發現糖基化可以顯著降低乳球蛋白的致敏性；Chen Yingjia等[6]發現美拉德改性后的β-乳球蛋白熱穩定性得到改善。盡管糖基化能夠改善蛋白的功能性能，但是單靠單一的修飾并不能得到滿意的結果。

高強度（低頻率）超聲波是多被用于食物加工中。超聲波協同糖基化能夠更好改善蛋白質的結構和功能性質，如超聲波預處理牛血清白蛋白，其糖基化程度加深，乳化性和乳化穩定性進一步增強[7]；超聲作用和糖基化能破壞α-LA的結構，糖基化能顯著提高α-LA的抗氧化活性[8]和降低其致敏性[9]。因此，超聲預處理與糖基化結合后α-LA的構象變化與抗氧化活性有關。

然而，目前的研究主要集中在干燥狀態或者濕熱狀態下美拉德反應法制備一種α-LA糖軛合物，關于不同糖類在干熱狀態下美拉德反應的α-LA資料很少，單一糖基化對蛋白功能的研究很多，不同還原糖糖基化結合超聲波預處理對α-LA抗氧化活性的研究鮮見報道。因此本研究將采用食品工業中廣泛應用的兩種還原糖（葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man））和一種稀有糖（阿洛糖（allose，All））與α-LA進行干熱處理下的抗氧化活性研究。首先將超聲技術應用于α-LA的結構擾動，然后將超聲預處理后的α-LA進行糖基化。通過對蛋白一級結構、二級結構和三級結構的分析，以還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除活性評價α-LA的抗氧化活性。以期為超聲預處理聯合糖基化誘導α-LA結構變化與抗氧化活性之間關系的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-LA、D-Glc、D-All、D-Man 美國Sigma公司；蛋白分子質量Marker 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑純度均為分析純或以上。

1.2 儀器與設備

JY98-IIIDN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90型粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；ChemiDoc MP化學發光凝膠成像系統美國Bio-Rad公司；MTB Module電泳儀 美國伯樂公司；Synergy全功能酶標儀 美國BioTek儀器有限公司；Bio-Logic MOS 450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1α-LA超聲樣品的制備

1 mg/mL的α-LA溶液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer，PBS）溶解，放入超聲波細胞破碎儀中進行超聲處理。超聲功率和時間為130 W、10 min，整個超聲過程都在冰浴中進行，超聲完畢后，放在4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 糖基化樣品的制備

分別取40 mg的Glc、All、Man于40 mL超聲處理后的α-LA溶液中，混勻，凍干。將凍干樣品置于相對濕度65%和55 ℃的糖基化反應模型中，反應6 h，反應完畢后將離心管至于4 ℃冰箱中終止反應，用PBS（10 mmol/L pH 7.4）復溶，然后采用3 kDa的超濾離心管（Millipore，BedFord，MA，USA）除去未反應的糖及鹽分，為了進一步去除未結合的還原糖，將混合液移入透析袋中于4 ℃持續攪拌透析24 h，每天更換3 次超純水，透析后，凍干。置于4 ℃冰箱中待用。天然的α-LA命名為LA；僅超聲波處理的α-LA命名為ULA；Glc、All、Man糖基化修飾的α-LA分別命名為Glc-LA、All-LA和Man-LA；Glc、All、Man糖基化修飾的超聲預處理α-LA分別命名為U-Glc-LA、U-All-LA和U-Man-LA。

1.3.3 Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

依次配制分離膠、夾層膠和濃縮膠，3種膠的制膠體積比為4∶1∶1。取10 μL樣品（1 mg/mL）上樣，以蛋白質Marker（3.3～31.0 kDa）為標準測定蛋白質的分子質量。

1.3.4 游離氨基含量測定

參照劉俊[10]的方法并作適當修改。測定時取100 μL的樣品（蛋白質量濃度4 mg/mL）與2 mL鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）溶液混合，室溫避光放置2 min。反應結束后，使用酶標儀在340 nm波長處測其吸光度，以在OPA試劑中加入100 μL去離子水為空白樣。

1.3.5 粒徑測定

參照張婧倩等[11]的方法，將所有樣品稀釋成0.25 mg/mL，采用馬爾文激光粒度儀檢測其粒徑。樣品于25 ℃平衡3 min，每個樣品掃描3 次取平均值。

1.3.6 圓二色譜掃描

根據Yang Wenhua等[12]的方法并進行適當修改，將所有樣品用超純水稀釋成0.5 mg/mL。設定參數為：光譜掃描范圍190～250 nm，掃描速率60 nm/min，狹縫寬度1 nm。在室溫下測定，連續掃描3 次取平均值。在http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/網站上進一步分析。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Yang Wenhua等[13]的方法進行一定修改。1 mL樣品加入5 μL 8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（8 mmol/L，pH 7.4）溶液，取200 μL混合液體加入到比色皿中，利用熒光光譜儀進行熒光光譜分析，激發波長和發射波長分別為390 nm和470 nm，測量熒光強度，將熒光強度對蛋白質濃度的作圖進行擬合，其斜率即為表面疏水性。

1.3.8 抗氧化活性測定

1.3.8.1 還原力的測定

參考Medjkouh等[14]的方法并作適當修改。首先將500 μL 1%的K3[Fe(CN)]6溶液與等體積的PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）混勻，再加入500 μL 10 mg/mL樣品溶液，混合均勻后于50 ℃水浴加熱20 min。反應結束后放入冰浴中冷卻混合溶液，再加入500 μL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混合均勻后再于室溫8 000×g離心10 min，然后取400 μL上清液與400 μL蒸餾水和80 μL 0.1%的K3[Fe(CN)]6溶液混合，取上述混合液200 μL于酶標板上，在酶標儀上測定波長700 nm處的吸光度。

1.3.8.2 DPPH自由基清除率的測定

參考Wen Chaoting等[15]的方法并作適當修改。首先將500 μL 10 mg/mL的樣品溶液與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合，于室溫下避光反應30 min后，取200 μL于酶標板上，在酶標儀上測定波長517 nm處的吸光度，同時以超純水為空白對照。DPPH自由基清除率計算如下：

式中：AS為樣品在517 nm波長處的吸光度；AC為對照品在517 nm波長處的吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

參照Chang等[16]的方法并作適當修改。7 mmol/L的ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混勻，避光室溫反應12 h備用，此為ABTS陽離子自由基工作液。將反應12 h后的ABTS陽離子自由基溶液用超純水稀釋到734 nm波長處吸光度為0.70±0.02后備用。取80 μL的樣品溶液，加入3.92 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液，混合均勻，室溫反應10 min，于734 nm波長處測定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率計算如下：

式中：AD為樣品在734 nm波長處的吸光度；AC為對照品在734 nm波長處的吸光度。

1.4 數據統計學分析

2 結果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE

如圖1所示，與未處理的LA（1泳道）比較，僅超聲波處理的ULA條帶（2泳道）未發生明顯變化，超聲波協同糖基化反應處理的α-LA條帶（3～8泳道）明顯上移，這說明糖基化后α-LA的分子質量增加，α-LA與糖分子形成共價鍵。

圖1 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA分子質量的影響Fig. 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on the molecular mass of ultrasonic pretreated α-LA

2.2 α-LA和不同還原糖糖基化反應氨基含量

以往研究表明賴氨酸是還原糖的主要糖基化位點，而精氨酸是不常見的糖基化位點，糖基化程度的增加會減少游離氨基數量[17-18]。如表1所示，與LA相比，僅ULA游離氨基含量變化不明顯，但糖基化后的α-LA游離氨基含量發生了不同程度的減少，且超聲預處理的α-LA游離氨基含量變化進一步增大（P＜0.05），說明超聲波促進了α-LA的糖基化反應，使得糖基化反應程度進一步增大。Glc、All、Man都是六碳醛糖，結構上的唯一區別是C2和C3的構型不同，導致不同糖基化樣品接枝度發生顯著差異。其中，All修飾的α-LA具有最低的游離氨基含量和最高的接枝度，說明糖基化反應程度最高。這可能是由于超聲波破壞了蛋白質的結構，使得蛋白構象變得松散，更有益于糖分子的接入，且All的構型更易于發生糖基化反應。Yang Yipeng等[19]研究了卵清蛋白（ovalbumin，OVA）與5種不同的單糖發生糖基化，結果顯示All糖基化OVA的游離氨基含量最低。

表1 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA游離氨基含量的影響Table 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on free amino contents of ultrasonic pretreated α-LA %

2.3 粒徑及其分布

由圖2可知，經過超聲預處理和糖基化后的α-LA，平均粒徑從242 nm增加到了792 nm，多分散指數（polymer dispersity index，PDI）從0.425增加到0.794。說明超聲波糖基化改變了α-LA的結構，蛋白結構變得更加松散，粒徑分布跨度增大。其中，All修飾的α-LA平均粒徑和PDI最大，這可能是由于α-LA分子結合了更多All，這與之前的接枝度結果一致。馬秋平等[20]發現因為單糖分子的接入，蛋白構象遭到破壞，使得蛋白粒徑增大。胡淼等[21]發現過度的熱處理會使蛋白發生聚集，導致BMPIDextran共價復合物乳液的平均粒徑增大，乳化性降低。孟軒夷[22]通過粒徑和電鏡觀察發現亞麻酸的加入能引起乳蛋白分子聚合形成高聚物增加β-乳球蛋白和α-LA的顆粒大小。

圖2 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA平均粒徑和PDI的影響Fig. 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on average particle size and PDI of ultrasonic pretreated α-LA

2.4 二級結構分析

如表2所示，超聲及糖基化處理后的α-LA二級結構含量發生了明顯變化。與LA相比，α-螺旋結構相對含量減少，β-折疊增加。這與Stathopulos等[23]的結果一致，超聲處理可以明顯影響蛋白的二級結構，誘導蛋白聚合作用從而導致α-螺旋相對含量減少而β-折疊相對含量增加；Ma Xiaojuan等[24]的研究表明，糖基化可以使得蛋白β-折疊含量增加。由于糖基化，它可能會以β-轉角或無規結構為代價增加β-折疊相對含量，將蛋白質結構的幾何形狀轉變為更穩定的形式[13]。但是，Yang Wenhua等[25]報道，β-Lg經過糖基化修飾后α-螺旋相對含量增加，β-折疊相對含量減少，糖基化可以使得蛋白β-折疊轉換為α-螺旋。不同結果可能是由于糖化反應pH值、溫度、水分活度和蛋白質等條件不同所致。

表2 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA二級結構的影響Table 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on secondary structures of ultrasonic pretreated α-LA%

2.5 表面疏水性分析

圖3 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of glycation with different reducing saccharides on surface hydrophobicity of ultrasonic pretreated α-LA

如圖3所示，與LA相比，糖基化樣品的表面疏水性發生了不同程度的降低。這與之前研究一致，糖基化顯著降低了蛋白的表面疏水性[26-27]。在這3種還原糖中，Glc修飾的α-LA表面疏水性最低。由于ANS可以強結合陽離子基團，如賴氨酸和精氨酸殘基，而賴氨酸和精氨酸殘基是糖基化反應的主要位點[28]。超聲預處理使得蛋白質的構象發生去折疊，可促進賴氨酸和/或精氨酸殘基與還原糖結合，使ANS能夠結合的陽離子基團減少，最終導致其表面疏水性降低。此外，糖分子的引入增加了糖-蛋白分子表面的空間位阻和親水性，抑制了ANS對這些疏水性基團的可及性[29]。

2.6 抗氧化活性分析

圖4 不同還原糖的糖基化反應對超聲波預處理α-LA抗氧化性的影響Fig. 4 Effect of glycation with different reducing saccharides on the antioxidant activities of ultrasonic pretreated α-LA

DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力可以反映超聲糖基化樣品的抗氧化能力。以樣品在700 nm波長處吸光度表示還原力的大小。如圖4A所示，超聲糖基化后的α-LA還原力顯著提高（P＜0.05），其中All修飾的α-LA具有最高的吸光度，且超聲預處理α-LA吸光度進一步提高。超聲糖基化樣品DPPH自由基清除能力見圖4B，與還原力的測定有相似結果，糖基化后的α-LA自由基清除能力顯著提高，其抗氧化活性順序為All＞Man＞Glc。圖4C中雖然3種糖修飾的α-LA對ABTS陽離子自由基清除能力無顯著差異，但是All修飾的α-LA仍具有最高自由基清除能力，且超聲進一步提高其自由基清除能力，說明糖基化程度越高，蛋白抗氧化活性越強。Yang Wenhua等[12]也得到相似的結果，高強度超聲預處理可增強OVAMan結合物的抗氧化活性。此外，從圖4B、C可以看出，α-LA的ABTS陽離子自由基清除能力高于DPPH自由基清除能力，這說明超聲預處理的糖基化α-LA水溶性較高，更易與水溶性的ABTS陽離子自由基結合，而與脂溶性的DPPH反應程度較低。

糖基化結合超聲波預處理增強α-LA抗氧化活性，可能是由于糖基化反應過程中產生了一些還原酮類中間物質，能夠提供氫離子等抗氧化物質，與自由基結合，形成穩定的分子[30]，而且高分子質量的美拉德反應產物具有較強的還原性[31]，使得產物的抗氧化能力顯著提高。另一方面超聲使得蛋白結構變得松散，更有利于糖分子的接入，糖基化程度增大，此外超聲空化作用可以產生羥自由基[32]，促進糖基化反應。總之，超聲波協同糖基化顯著增強了α-LA的抗氧化活性，且超聲波預處理促進了這種增強作用。因此，超聲波協同糖基化是一種很有前景的制備食品加工抗氧化劑的方法。

3 結 論

研究發現，糖基化結合超聲波預處理誘導α-LA結構變化與其抗氧化活性增強有著密切相關性。其中，All修飾的α-LA接枝度最高，抗氧化活性最強。糖基化結合超聲波預處理提高了α-LA的平均粒徑，擴大了粒徑分布范圍；改變了α-LA的二級結構，提高了β-折疊相對含量，降低了α-螺旋相對含量；改變了α-LA的三級結構。因此，糖基化結合超聲波預處理是一種很有前景的提升α-LA功能特性的方法。然而，在此條件下糖基化結合超聲波預處理增強α-LA抗氧化活性的機制需要進一步深入研究。