基于礦物元素指紋的地理標志羊肉真實性鑒別

齊 婧，李瑩瑩，姜 銳，張 晨，張順亮，郭文萍，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

地域特色產品所具有的品質特性主要取決于產地的自然因素。經審核批準以地理名稱進行命名的產品，受到國家法律或國際條約的相關權利保護[1]。在中國，鹽池灘羊、蘇尼特羊、巴里坤哈薩克羊都是地理標志羊種。這些羊肉因得天獨厚的地理環境培養的獨特品質，備受消費者推崇[2]，其價格明顯高于普通羊肉。錯貼標簽或者故意假冒的違法行為會給合法的生產者和消費者帶來不利影響。要對地理標志羊肉進行法律保護、維護市場秩序、保障消費者權益，需要一種真實性鑒別和判斷技術的支撐。

礦物元素指紋分析被認為是食品產地溯源領域最可靠的技術之一[3-4]，不同地域特色羊肉體內礦物元素的組成受到區域氣候條件、生物環境相互作用和生物代謝等的影響而存在指紋差異。目前大量文獻報道了應用礦物元素分析進行肉類產地溯源的研究[5-8]，礦物質元素分析技術對于肉類產地溯源可靠，并具有廣泛應用前景。基于礦物元素的食品產地溯源研究的思路比較統一：1）樣品收集；2）多元素分析法的開發；3）多元素分析數據的積累；4）化學計量學分析數據；5）驗證構建模型的有效性；6）實例驗證[9]。其中數據分析與建模是關鍵技術之一，目前的研究都是采用監督模式的判別分析方法和分類算法，例如線性判別分析、偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等[10-16]。判別分析方法的局限性是只適用于收集到樣本的種類和范圍，更廣泛的應用需要非常大的數據量構建系統數據模型。例如，要驗證地理標志羊肉鹽池灘羊的真實性則需要收集所有的可能欺詐類型，這顯然是不現實的，因此該技術用于真實性鑒別的發展受到了限制。

針對某一種高值的地理標志羊肉真實性而言，單分類建模方法具有非常大的應用性能。單分類策略是將真實類視為目標類，將其劃定邊界生成一個模型，建模時沒有其他非真實樣本的貢獻，在預測階段，如果未知樣本與目標類匹配，則將其視為真實樣本，如果不匹配，則為非真實樣本[17]。單分類方法主要有類類比軟獨立建模（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、單分類支持向量機（One-Class SVM）和基于PLS方法等[18]。相較于目前常用的監督分類方法，單分類建模最大的優點是不需要包含所有可能形式的欺詐樣本，減少了樣本和數據收集的系統工作量，在真實性鑒別領域具有更廣泛的應用性能[19]。目前單分類方法主要應用于基于光譜數據的食品認證、原產地確認和真實性鑒別。比如解決基于近紅外光譜的橄欖油和蜂蜜的真實性問題[20]，Xu Lu等[21]應用單分類建模手段，通過對近紅外光譜數據集的分析，用于安吉白茶的地理產地識別和純芝麻油的摻假鑒別，以及西湖藕粉的原產地分析[22]。Rodionova等[23]以基于近紅外數據鑒別牛至草真實性為實例，驗證單分類模型的應用性能，證明其可以成功地應用于揭露各種類型的偽造食品。Meza-Márquez等[24]應用SIMCA分析中紅外數據，研究肉糜參雜檢測。Vinciguerra等[25]將其應用于基于三維熒光光譜數據的巴西紅酒的產地真實性鑒別。單分類建模被認為是一種非常適用于非目標分析的分類器[23]。盡管單分類方法更適合于解決許多實際問題，但是它的應用仍然不多，主要原因之一是這些方法在目前的化學計量學包（包括商業的、免費的和開源的）中缺乏[26]。目前也還沒有報道將單分類建模方法應用于我國地理標志羊肉的真實性鑒別中，我國研究還是普遍采用傳統的判別手段[27-30]，因此技術停留在只能對所搜集樣本種類進行鑒別的瓶頸階段。

本實驗采用電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀測定鹽池灘羊、巴里坤哈薩克羊、蘇尼特羊3種地理標志羊肉礦物元素，分析其礦物元素特征，應用最常用的單分類建模方法SIMCA[19]分別對3種羊肉建模，研究基于礦物元素指紋結合單分類建模方法實現我國地理標志羊肉真實性鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所采集的寧夏灘羊樣本n=20，哈薩克羊樣本n=18，蘇尼特羊樣本n=15。鹽池灘羊采集自寧夏鹽池縣、巴里坤哈薩克羊采集自新疆巴里坤哈薩克自治縣、蘇尼特羊采集自內蒙古錫林郭勒盟。采集樣品均為7～10 月齡健康羊的后腿肉。同時采集市售16 個普通羊肉樣品，用于地理標志羊肉真實性模型驗證。樣品為羊瘦肉樣品，樣品采集后，將樣品保存在-20 ℃條件下直至處理。

65%硝酸、30%過氧化氫（均為優級純） 國藥集團化學試劑有限公司；多元素標準品（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K） 加拿大SCP Science公司；Rh、Re、In、Ge標準品 美國Inorganic Ventures公司。

1.2 儀器與設備

HM100攪拌機 中國Grindertech公司；TOPEX+微波消解系統 中國PreeKem科學儀器有限公司；ICAP RQ ICP-MS聯用儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將樣品切成小塊，并在攪拌機中斬拌均勻。稱取約0.500 0 g斬拌均勻的樣品，加入6 mL的65%硝酸和2 mL的30%過氧化氫進行微波消解。將消化后的溶液轉移到塑料樣品管中，并用超純水（18.2 MΩ·cm，20 ℃）定容至15 mL。每個樣品進行2 次平行實驗。

1.3.2 樣品測定

用ICP-MS測定礦物元素含量（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K）。

ICP-MS最佳操作條件如下：射頻功率1 550 W，氦氣流量4.35 mL/min，石英玻璃同心霧化器，采樣時間為0.1 s，重復2 次。Rh、Re、In和Ge的內標溶液用于消除基質效應和儀器偏差。內標溶液為單元素標準溶液配制成質量濃度為10 μg/L的混合溶液。采用外標法進行定量分析，標準曲線的線性回歸系數大于0.99。所有結果均為2 次平行測試結果的平均值。

1.4 數據處理

采用SPSS（版本22.0，美國IBM）進行方差分析（ANOVA）、多重比較分析，研究不同地理來源樣品中礦物元素數據的差異。用安捷倫Mass Profiler Professional軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）并作三維PCA散點圖。使用SIMCA-P（版本14.0，Umetrics AB）對樣本數據進行單分類建模，以及測試集的真實性驗證。

2 結果與分析

2.1 不同地理標志羊肉中礦物元素含量差異分析

2.1.1 元素含量

表1 不同地理標志羊肉中元素含量水平Table 1 Concentration levels of elements in mutton from different sheep breeds under the protection of geographical indication

測定不同地理標志羊肉樣品中B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K元素含量，有的痕量元素含量低于或接近檢出限（檢出限數據參照本課題組之前的研究數據[8]），不適用于元素含量的測定和分析，排除含量低于或接近檢出限的元素，篩選出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Na、Mg、K共13 個元素進行統計分析，結果見表1。由表1可知，羊肉中K含量最高，Na與K相同，也是機體保持滲透壓并參與神經興奮的關鍵元素，Na是含量第2高的元素，其次是常量元素Mg、Ca、Zn、Fe，其他元素含量較少，各元素的含量水平與文獻報道一定范圍內存在差異，是由于地區、喂養系統和肉的部位差異引起。變異系數是通過測定同一來源樣本的元素含量相對標準偏差評估離散度。如果離散度過大，則意味著來自同一產地羊肉樣品含量差異較大，不適合用作溯源變量。從表1看出，篩選的元素離散度相對不大，可以作為溯源變量。

2.1.2 差異分析

圖1 各地理標志羊肉元素含量（Z-score標準化）指紋圖譜Fig. 1 Fingerprint profile of characteristic elements (Z-score standardized) in geographical indication mutton

為探究不同地理標志羊肉中礦物元素含量的差異，進行方差分析、多重比較分析以及PCA。方差分析結果顯示（表1），樣品中Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti的P值均小于0.05，這表明這10種元素在地區之間具有顯著差異。通過多重比較分析比較來自不同產地羊肉樣品中元素的平均值，以發現差異來源。需要3種羊肉之間兩兩比較，方差齊性的元素，選擇拜佛倫尼多重比較，方差不齊的元素選擇塔姆黑尼多重比較。比較結果顯示：蘇尼特羊Ca和Ti含量顯著高于鹽池灘羊和巴里坤哈薩克羊，蘇尼特羊的Cu和K含量顯著低于鹽池灘羊和巴里坤哈薩克羊，巴里坤哈薩克羊中Fe、Zn和Se含量顯著高于鹽池灘羊和蘇尼特羊，鹽池灘羊的Na含量顯著低于巴里坤哈薩克羊和蘇尼特羊，3種羊肉之間的Sb和Sr含量均存在顯著差異，鹽池灘羊的Sb含量最高，其次是巴里坤哈薩克羊，蘇尼特羊最低，蘇尼特羊的Sr含量最高，其次是鹽池灘羊，巴里坤哈薩克羊Sr含量最低。Rb和Sr作為能顯示地球化學行為的元素，其含量因養殖地質環境不同而變化，從而能提供更好的原產地信息。為了將多重比較分析的結果可視化，更直觀地看出不同地理標志羊肉之間的礦物元素含量差異，繪制不同地理標志羊肉礦物元素含量指紋圖，可見每種羊肉樣品都有特征元素含量分布（圖1）。因為不同元素含量從μg/kg到g/kg，含量數量級跨度較大，為了在同一量度范圍內比較，對數據進行Z-score標準化。

2.1.3 PCA結果

使用ANOVA選擇的具有顯著區域差異的10種元素進行PCA。由于各個特征之間的數量級存在較大差異，就會使較小的數被淹沒，因此PCA前對數據進行了log2轉化。前3 個PC的方差貢獻率分別為39.35%、21.5%、11.95%，累計方差貢獻率為72.8%，認為可以足夠解釋原始數據信息。由圖2可以看出，3種羊肉區分明顯，由此可見3種羊肉中礦物元素變量之間存在可分類的差異。

圖2 前3 個PC 3D得分散點圖Fig. 2 3D score scatter plot of first three principal components PC1,PC2 and PC3

2.2 SIMCA單分類模型的建立與地理標志羊肉樣品真實性鑒別

所采集的鹽池灘羊15 個樣本用于訓練集，5 個樣本用于測試集，巴里坤哈薩克羊15 個樣本用于訓練集，3 個樣本用于測試集，蘇尼特羊12 個樣本用于訓練集，3 個樣本用于測試集。同時采集市售16 個普通羊肉樣品，用于地理標志羊肉真實性模型驗證。用每種羊肉訓練集樣本分別建立SIMCA的PCA-Class模型，使用ANOVA選擇的具有顯著差異的10種元素進行建模，模型PC的個數由Q2（cum）值決定，Q2（cum）表明的是當前主成分數量時總的模型預測能力，當增加的1 個PC不能提升交叉驗證的數據質量時，Q2（cum）會下降，因此當Q2（cum）達到最高值時對應的PC個數為最有效PC個數。巴里坤哈薩克羊模型2 個PC，蘇尼特羊模型1 個PC，鹽池灘羊模型1 個PC。ROC曲線圖可反映敏感性與特異性之間關系，其中X軸為特異性，Y軸為敏感度，X越小Y越大，準確率越高。ROC曲線下面積值越接近1，說明預測準確率越高。從圖3、4結果看，建立的模型性能優良。圖4a、d是以哈薩克羊建立的SIMCA模型，圖4b、e是以蘇尼特羊建立的SIMCA模型，圖4c、f是以灘羊建立的SIMCA模型，其中，紅線為95%置信區間臨界距離，處于紅線下方的樣本被認為是建模的羊種，3 個模型中3種羊肉都被準確判別。將測試集帶入每種羊肉模型中（圖4d、e、f），可以看出每種羊肉的模型均能將真實樣品成功鑒別出，其他不屬于所驗證的地域特色羊肉（欺詐樣本）也均被識別。所以地理標志羊肉的礦物元素含量具有明顯的特征差異，作為SIMCA模型變量，能夠實現地理標志羊肉真實性的100%鑒別準確率。

圖3 3 個分類模型的ROC曲線及曲線下面積Fig. 3 Area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC)

圖4 3種地理標志羊種分類模型預測DModX圖Fig. 4 DModX charts for the prediction performance of classification models for three geographical indication sheep breeds

3 結 論

測定3種地理標志羊肉中多種礦物元素含量，篩選出13 個元素作為真實性鑒別分析變量。通過方差分析、多重比較分析以及PCA分析3種羊肉中礦物元素含量之間差異，探究地理標志羊肉中礦物元素指紋特征。用特征礦物元素變量（Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti）針對每種地理標志羊肉建立SIMCA模型，研究表明模型性能優良，模型能夠從多種欺詐樣本中識別真實樣本，達到100%鑒別準確率。

本研究探索了基于礦物元素指紋結合單分類建模策略的地理標志羊肉真實性鑒別技術。該技術突破了目前我國研究羊肉產地溯源領域傳統判別手段只能針對所收集樣本范圍內的產地真實性鑒別的瓶頸。實現了只需要收集一類目標樣品，就可以從所有欺詐樣本中鑒別真實本，減少了樣本和數據收集的系統工作量，在真實性鑒別領域具有更廣泛的應用性能。