固相萃取-氣相色譜質譜法測定食品中9種大麻素

唐慶強，夏林兵，曹 丹，楊 方，吳春燈，薛昆鵬

（1.福州海關技術中心，福建 福州 350001；2.三明海關綜合技術服務中心，福建 三明 365001；3.杭州國際旅行衛生保健中心（杭州海關口岸門診部），浙江 杭州 310016；4.金華海關綜合技術服務中心，浙江 金華 321001；5.浙江月旭材料科技有限公司，浙江 金華 321001）

大麻素是大麻植物中天然含有的一類萜酚類化合物[1]，其中Δ9-四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）具有較強的精神活性和致幻成癮作用，被《麻醉品單一公約》[2]、《精神藥物公約》[3]和《聯合國禁止非法販運麻醉藥品和精神藥物公約》[4]等國際公約列為國際管制的毒品。合成大麻素是一類藥理、生理作用與Δ9-THC相似的化合物，最初由科學家以治療疾病的目的發明出來，但最終因其具有精神活性而被濫用[5]。合成大麻素在實驗室內就能夠人工合成，因此也被稱為“策劃藥”或“實驗室毒品”，其吸食成癮效果是天然大麻的4～5 倍[6]，現已成為使用量最大的新精神活性物質種類[7]。近年來，國際上對大麻管控的態度有所變化，大麻合法化運動在部分國家迅速蔓延[8]，世界衛生組織也在2018年向聯合國麻醉藥品委員會提出解除對低THC含量的大麻及產品列管的建議[9]。但我國和世界上其他國家對大麻制品，特別是合成大麻素都采取嚴格管控的措施，我國《麻醉藥品品種目錄》、《精神藥品品種目錄》[10]、《非藥用麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》[11]和歷次增補公告[12-13]中，先后將48種合成大麻素和7種合成大麻素化學結構通式列為管制品。但不法分子為逃避打擊，不斷修改化合物的結構從而開發出新種類的合成大麻素，目前已從第一代的萘甲酰基吲哚類發展至第八代的吲哚酰胺類[14-15]。不僅如此，不法分子還將大麻素噴灑在香料或藥草上晾干，以減少被識別的概率，甚至還偽裝成奶茶、咖啡、餅干、開心果、飲料、酒或糖果等各種食品[16-19]，具有極強的隱蔽性和社會危害性。

當前檢測大麻素的方法大多針對毛發[20-21]、血液[22-23]、尿液[24-25]和疑似毒品[26-27]等基體，涉及食品基質的研究往往集中在THC、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）等天然大麻素上[28-30]，對少數特定食品中合成大麻素[31-32]結構、種類的研究較少。現有研究無法滿足當前已出現在多種食品中非法添加合成大麻素的現狀。

本研究結合已公布的非法添加報道，選擇有代表性的食品基質，以9種常見的大麻素為分析對象，結構上涵蓋了天然大麻素和萘甲酰基吲哚、環己基苯酚、苯酰基吲哚和吲哚酰胺類等多種類型的合成大麻素（表1），對操作條件進行優化，建立適用于多種食品基質中大麻素的固相萃取-氣相色譜質譜分析方法。

表1 9種大麻素信息Table 1 Information about nine cannabinoids tested in this study

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Δ9-THC、CBN、CBD、戊基-3-(4-乙基-1-萘甲酰基)吲哚（JWH-210）、順式-5-(1,1-二甲基庚基)-2-[(1R,3S)-3-羥基環己基]苯酚（CP-47497）、1-(5-氟戊基)-3-(1-萘甲酰基)-1H-吲哚（AM2201）、戊基-3-(4-甲氧基苯甲酰基)吲哚（RCS-4）、N-(1-氨甲酰基-2-甲基丙基)-1-(環己基甲基)吲唑-3-甲酰胺（AB-CHMINACA）和N-(1-氨甲酰基-2,2-二甲基丙基)-1-戊基吲唑-3-甲酰胺（ADB-PINACA）標準溶液（質量濃度均為1 mg/mL）天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（100 mg，3 mL） 美國安捷倫科技公司；Oasis二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮（HLB）固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國Waters公司；其他試劑均為國產分析純或優級純；實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》中規定的一級水。

橄欖油、豬肉、牛奶、蜂蜜、面包、茶葉、大豆、可樂和啤酒均購自當地超市。火麻仁、火麻籽、火麻茶、火麻糊、火麻油、火麻膏和火麻粉均購自廣西火麻食品專賣店。

1.2 儀器與設備

Trace1300/ISQ7000型氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；3-18K高速離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

混合標準溶液：移取適量9種大麻素標準溶液，用甲醇稀釋配制成1.0 μg/mL的混合標準工作液，于-20 ℃避光保存。

基質標準曲線：選擇與被測樣品性質相同或相似的空白樣品按照1.3.2節進行前處理，得到空白基質溶液。精確吸取一定量的混合標準溶液，用空白基質溶液逐級稀釋成質量濃度為10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的基質標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

橄欖油：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液待凈化。

大豆、豬肉、面包、蜂蜜、茶葉：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液；加入5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

牛奶：稱樣1.00 g（精確至0.01g）于50 mL離心管中，加入5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，再加入1 g三氯乙酸，靜置15～20 min沉淀蛋白質后，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液；加5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

可樂、啤酒：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液，加5 mL水稀釋后渦旋混勻后待凈化。

1.3.2.2 樣品凈化

橄欖油：將待凈化液轉移至事先用2 mL乙腈活化過的EMR固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，減壓抽干30 s。上樣和洗脫流速均應小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測定。

其他樣品：將待凈化液轉移至事先用5 mL甲醇和5 mL水活化過的HLB固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL 50%甲醇溶液淋洗小柱，棄去全部淋洗液并減壓抽干30 s，用5 mL乙腈洗脫小柱。上樣和洗脫流速均應小于1 mL/min。收集全部洗脫液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測定。

1.3.3 固相萃取氣相色譜-質譜分析

1.3.3.1 色譜條件

HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度290 ℃；進樣量1.0 μL；不分流進樣；載氣為高純氦氣（99.999%）；流速為恒定流量1.5 mL/min；升溫程序：初始70 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至180 ℃；再以15 ℃/min升至300 ℃，保持9 min。

1.3.3.2 質譜條件

電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度310 ℃；傳輸線溫度290 ℃；溶劑延遲時間7.5 min；檢測方式為選擇離子監測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

大麻素主要為非極性和弱極性化合物，本實驗比較了中等極性的DB-17MS色譜柱和非極性的HP-5MS色譜柱測定9種大麻素的效果。結果表明，兩種色譜柱均可實現9種大麻素的全部分離；但除JWH-210外，使用HP-5MS色譜柱測定的峰面積均高于DB-17MS，平均峰面積為后者的1.8 倍。這可能與HP-5MS色譜柱（固定相）對分離的目標物具有選擇寬泛的特點，對非極性和弱極性化合物的分離效果更佳有關。考慮到同時分析多種目標物的需要，選擇HP-5MS色譜柱進行測定，選擇離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 9種大麻素標準品的選擇離子流色譜圖Fig. 1 Selected ion monitoring chromatogram of mixed standard of nine cannabinoids

考察了250～310 ℃進樣口溫度下9種大麻素峰面積情況。如圖2所示，隨著進樣口溫度的升高，9種大麻素的峰面積呈現整體上升趨勢，在進樣口290～300 ℃下達到最高。為進一步明確最佳的進樣口溫度，在290 ℃和300 ℃的進樣口溫度下分別連續進樣6 次，比較精密度，結果顯示，290 ℃進樣口溫度下峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.5%～5.8%，300 ℃進樣口溫度下峰面積的RSD為1.8%～11.2%。因此，選擇290 ℃進樣口溫度作為實驗條件。

圖2 不同進樣口溫度下的峰面積Fig. 2 Peak areas at different inlet temperatures

2.2 質譜條件優化

比較了質譜中全掃描和選擇離子監測模式同時分析9種大麻素的情況。先用單級質譜的全掃描模式獲得9種目標物的總離子流色譜圖，確定每種大麻素的保留時間，再用選擇離子監測模式建立5 組多通道時間段，每個時間段內掃描1～3 個化合物，每種化合物選擇定量離子1 個，定性離子2～3 個，得到9種大麻素的離子信息，如表2所示。

表2 9種大麻素的保留時間和監測離子Table 2 Retention times and monitoring ions of the nine cannabinoids

2.3 提取條件的優化

考察了甲醇和乙腈這兩種文獻中檢測大麻最常用的提取溶劑[22-28]，使用空白樣品加標的方式比較兩種溶劑對大麻素的提取效果，結果表明，兩種溶液均有較好的提取效果，橄欖油基質中乙腈對各種大麻素的平均提取回收率為93.7%，高于甲醇提取時的85.0%；而其他基質中甲醇對各目標物的提取回收率均大于90%，高于乙腈的74.3%。為驗證這一結論，使用天然含有Δ9-THC、CBD、CBN的火麻油、火麻仁和火麻茶樣品，用峰面積比較兩種溶劑的提取效果。由圖3可知，實際樣品中的提取效果與上述空白樣品加標實驗結果一致。因此，選用乙腈作為油脂類樣品的提取溶劑，用甲醇作為其他樣品的提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對火麻油、火麻仁和火麻茶的提取效果比較Fig. 3 Comparison of extraction efficiencies of different extraction solvents for hemp oil, hemp seed and hemp tea

還比較了渦旋提取、均質提取和超聲提取等方式的提取效率，結果表明，在相同的提取時間下，超聲提取對各種大麻素的提取效率均高于90%，優于渦旋振蕩和均質提取的效率。繼續對超聲提取的時間和溫度進行優化，由圖4可知，超聲溫度對各大麻素的影響差別不大，整體上當超聲溫度高于50 ℃時，峰面積趨于穩定；當超聲時間大于15 min時，目標物的峰面積基本不再增加。因此，最佳提取條件為：使用乙腈作為油脂類樣品的提取溶劑，用甲醇作為其他類別樣品的提取溶劑，并在50 ℃下超聲提取15 min。

圖4 不同超聲時間和超聲溫度對提取效果的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic temperature and time on the recoveries of nine cannabinoids

2.4 凈化方法的優化

根據基質的特點和目標物的結構特性結合參考相關文獻，使用空白樣品加標的方式，比較了中性氧化鋁小柱（Alumina-N）[33]、EMR固相萃取柱和凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）[34]對橄欖油樣品的凈化效果，還比較了HLB固相萃取柱和QuEChERS基質分散萃取[29-32]對其他基質樣品的凈化效果。

由圖5a可知，對于油類基質樣品，Alumina-N回收率一般，EMR固相萃取柱和GPC凈化方法都能取得較好的回收率，但GPC凈化操作繁瑣、耗時長且需額外增加凝膠滲透色譜儀設備，所以選擇EMR固相萃取柱凈化油類樣品。由圖5b可知，對于其他基質的樣品，HLB固相萃取柱的回收率優于QuEChERS方法，所以選擇HLB固相萃取柱凈化其他基質樣品。在此基礎上，進一步比較了BIOSIL、RayCure、Agela、BESEP等多個不同品牌的固相萃取柱和不同體積分數甲醇溶液和乙腈溶液作為淋洗液和洗脫液的結果，并結合基質效應影響的評估方法，研究了不同淋洗液和洗脫液體積（3～7 mL）對凈化效果的影響。結果表明，使用5 mL乙腈淋洗Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和使用5 mL 50%甲醇溶液洗脫Oasis HLB固相萃取柱時，能達到較好的回收率和凈化效果。

圖5 不同凈化方式對橄欖油樣品（a）和其他基質樣品（b）的凈化效果Fig. 5 Effects of different purification methods on the recoveries of cannabinoids from olive oil samples (a) and samples of other matrices (b)

2.5 內外標法選擇

比較了外標法和內標法在定量上的差別。當使用外標法定量時，在各目標物1、2、10 倍定量限（limit of quantitation，LOQ）3 個添加濃度水平的平均回收率為65.2%～117.9%。當使用Δ9-THC-D3作為內標定量時，各目標物的平均回收率為80.1%～142.7%，回收率普遍偏高。這可能是由于各種大麻素在結構和性質上存在差別，而只使用一種Δ9-THC的同位素內標時，無法同時對多種大麻素進行結果校正。由于很難獲得每種大麻素的同位素內標，外標法回收率的結果效果令人滿意，因此，最終采用外標法進行定量分析。

2.6 基質效應考察

氣相色譜-質譜分析時，由于待測成分的離子化效應被改變，導致目標化合物發生離子增強或抑制現象。本實驗涉及的食品基質較多，不同基質對目標物會產生不同的基質效應。參考Gonzalez等[35]的方法，使用甲醇配制的標準曲線斜率（kA）和用空白基質配制的相同濃度標準曲線斜率（kB）進行比較，按基質效應/%＝（kB-kA）/kA×100式子計算各種樣品的基質效應。|基質效應|＜20%時為弱基質效應；20%＜|基質效應|＜50%時為中等強度基質效應；|基質效應|＞50%時為強基質效應。結果表明，各種基質食品中9種大麻素整體呈現出基質增加，且面包、大豆、橄欖油樣品的基質效應相對較高，這可能與其油脂含量高有關。對此，根據降低基質效應的方法[36]，采取優化凈化條件、改善稀釋過程和使用空白基質配制標準曲線等方法減少和校正基質效應的影響，如圖6所示，各種基質的基質效應值在-21.3%～48.0%之間，均處在中等強度或弱基質效應范圍內，可以滿足檢測方法的要求。

圖6 9種不同基質食品中的基質效應情況Fig. 6 Matrix effect of the cannabinoids from nine different matrices

2.7 標準曲線、檢出限（limit of detection，LOD）和LOQ分析

精密吸取9種大麻素混合標準溶液，用甲醇稀釋成質量濃度為10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的系列混合標準工作溶液，按質量濃度由低到高的順序進樣分析。以9種大麻素化合物的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性方程和相關系數（R2）。由表3可知，9種大麻素在10～500 μg/L范圍內呈良好線性相關，R2均在0.999 2以上，能滿足測試工作的需求。在各陰性基質的樣品中分別添加1～100 μg/L的9種大麻素標準溶液，按優化后前處理方法和儀器條件測定，以定量離子信噪比為3和10時響應定義方法的LOD和LOQ。根據信噪比的結果，部分種類基質樣品的LOD和LOQ可以更低，但考慮到操作便捷和使用方便，基于最不靈敏化合物的LOD和LOQ進行了統一，各種基質中大麻素的LOD和LOQ分別為1～15 μg/kg和2.5～50 μg/kg。

表3 9種大麻素的回歸方程、R2、LOD和LOQTable 3 Regression equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the nine cannabinoids

2.8 準確度和精密度分析

為驗證方法的準確度和精密度，用空白的橄欖油、大豆等9種食品進行加標回收實驗，分別添加相當于1、2、10 倍LOQ的9種大麻素標準品，每個水平測定6 次，計算方法的回收率和精密度。由表4可知，9種大麻素在各種食品基質中的平均回收率為65.2%～117.9%，RSD為2.0%～12.7%，說明該方法準確度高、重復性好，能夠滿足多種食品基質中9種大麻素的定量分析要求。

2.9 實際樣品分析

應用建立的方法對市場購買的16種火麻食品進行測定，包括火麻茶、火麻油、火麻膏、火麻糊、火麻粉、火麻仁和火麻籽等。由表5可知，所有火麻食品均未檢出合成大麻素，但均不同程度地檢出CBD、Δ9-THC和CBN等天然大麻素，其中火麻油中大麻素的整體含量最高；不同品牌火麻油或火麻茶中3種大麻素含量差別較大，這可能與原料、產地、大麻籽用量等有關。

表4 9種大麻素在不同食品中添加回收率和RSD（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the nine cannabinoids spiked into different foods (n = 6)

表5 實際樣品中大麻素類化合物的檢測結果Table 5 Results of determination of cannabinoids in real samples μg/kg

3 結 論

通過優化色譜、質譜條件，建立了固相萃取氣相色譜-質譜聯用法對多種食品基質中9種大麻素的檢測方法，涵蓋了多種國內外關注的食品種類。結果表明，該方法操作簡單、快速，針對的大麻素種類包括了多種類型的合成大麻素，各種食品中的LOQ為2.5～50 μg/kg，加標的平均回收率為65.2%～117.9%，精密度（RSD）在2.0%～12.7%范圍內，均滿足國內外限量的要求，具有較好的實用性和適用性，為監控食品中非法添加的大麻素提供了技術支持和監測手段。