基于高效液相色譜-質譜聯用技術檢測畜肉中的瓜爾膠

郭 超，陳 超，李慧晨，王 真，徐若琳，趙文濤，李瑩瑩，郭文萍,2,*，張朝暉

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068；3.中國海關科學技術研究中心，北京 100026）

“注水肉”是指在生豬、牛、羊屠宰前或屠宰過程中，通過灌胃或向血管泵注等形式，將水摻入動物體內得到的生、鮮肉品[1]。注水肉是存在已久的行業亂象，目前“注水肉”不斷升級，“注膠肉”開始增多，注入“膠水”的肉品比“注水肉”更加難以識別，各種食用膠因具有強大的增稠性、保水性，被不法分子利用，各類媒體已多有報道[2-3]。膠水的成本低廉，制備“注膠肉”屬于欺詐行為，灌注的膠水中往往摻雜有防腐劑，可引入致病微生物、外來物質污染、重金屬超標等風險，危害食品安全[2]。

常見的食用膠有卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠等[4-5]。其中瓜爾膠是一種具有較強增稠效果的親水性膠體，是由甘露糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的主鏈和α-1,6糖苷鍵連接的半乳糖側鏈構成的半乳糖甘露聚糖，甘露糖與半乳糖物質的量比約為2∶1，分子質量2×106Da左右，自然或者微生物降解分子質量仍可達8×105Da[6-12]。其結構式如圖1所示。β-甘露聚糖酶是一類能夠酶解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露多糖的水解內切酶。經過β-甘露聚糖酶酶解后的瓜爾膠，只被切斷主鏈甘露糖的β-1,4糖苷鍵，而對通過α-1,6糖苷鍵相連的支鏈半乳糖沒有酶解作用，從而形成2～10 個單糖單元通過糖苷鍵連接的半乳甘露低聚糖[13-16]。

圖1 瓜爾膠的結構式Fig. 1 Structure of guar gum

GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中將瓜爾膠列為“可在各類食品中按生產需要適量使用的食品添加劑”，僅在稀奶油及較大嬰兒和幼兒配方食品中有限量[17]，因此瓜爾膠應用十分廣泛，被應用于各類食品中，包括雞血豆腐、牛肉糜制品、香腸等[18-21]，但生鮮肉不允許使用添加劑，近年來劣質肉類食材的不斷出現，“注水肉”、“注膠肉”等屢有報道，讓消費者防不勝防。

目前“注膠肉”尚無相關檢測標準或規范，僅可通過相關水分含量標準判斷。GB 18394—2020《畜禽肉水分限量》中規定的豬肉的水分質量分數不得高于76%[22]，由于識別的有效性欠缺，對違法樣品打擊力度不足[23-24]。目前國內外研究中采用最多檢測“注膠肉”的技術是低場核磁共振、近紅外、分子生物學等方法[25-31]。前2種方法均依賴于主成分分析、判別模型等化學計量學手段，不易推廣，而分子生物學方法基質干擾較為復雜，因此上述方法的使用難度較大，并且無法進行準確的定量，難以作為執法檢驗的依據，限制了其應用。

瓜爾膠分子質量大，因此常規手段難以檢測，有部分學者研究將瓜爾膠通過酸解或酶解等方式降解后再進行檢測，如離子色譜法[32-33]、液相色譜-串聯質譜法[34]。其中離子色譜法將瓜爾膠水解后測定單糖，但未能建立測定畜肉中瓜爾膠的定量方法。而將膠體經過水解后，利用液相色譜-串聯質譜儀對特定分子質量的小分子進行質譜檢測的方法更具有普適性，并且能夠避免假陽性判別的出現，但對于動物源性食品尤其是畜肉中水溶性膠體的液相色譜-質譜法檢測研究在國內外文獻中鮮見報道。因此本方法將膠體經過酶解后，利用液相色譜-串聯質譜儀對特定分子質量的小分子進行質譜檢測。針對新鮮肉品中瓜爾膠主要來源為人為添加，該方法可作為打擊“注膠”畜肉的有效技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國CNW公司；磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；β-甘露聚糖酶（CAS：37288-54-3，純度≥98%，10 000 U/g）、瓜爾膠（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1290II-6470高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Agilent公司；HM100刀式研磨儀 北京格瑞德曼儀器設備有限公司；Milli-Q Reference c超純水機 美國Millipore公司；EFAA-HM-01多管旋渦混合儀 上海安譜實驗科技股份有限公司；LYNX 4000型高速冷凍離心機美國Thermo公司；3K15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL） 美國Waters公司；C18固相萃取柱（200 mg/6 mL)、中性氧化鋁柱（500 mg/6 mL，200～300 目）、濾膜（PTFE，0.22 μm） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

緩沖溶液（pH 3.6）：磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取14.20 g Na2HPO4于燒杯中，用水溶解并轉移至500 mL容量瓶，定容；檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g一水合檸檬酸于燒杯中，用水溶解并轉移至1 000 mL容量瓶，定容。量取678 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液于燒杯中，加入約322 mL磷酸氫二鈉溶液調節pH值至3.6，混勻。

β-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL）：稱取0.01 gβ-甘露聚糖酶于具塞試管中，加入50 mL緩沖溶液，混勻。臨用現配。

0.1%甲酸溶液：移取甲酸1 mL至1 000 mL容量瓶中，用水定容，混勻。

1.3.2 樣品制備

稱取試樣2 g于50 mL離心管中，依次加入9 mL緩沖溶液（pH 3.6）和0.5 mLβ-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL），加蓋后渦旋10 min，放入（55±5）℃水浴振蕩器中酶解過夜（至少7 h），4 ℃、12 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至玻璃試管中，沸水浴中加熱10 min，冷卻后轉移至比色管中，用水定容至10 mL，搖勻后取1 mL于離心管中，加入1 mL乙腈混合搖勻，4 ℃、4 500 r/min離心2 min，取上清液待凈化。

取1 mL待凈化液，通過中性氧化鋁柱（無需活化），用刻度管接收流出液，再用2 mL水洗脫，合并接收液。將接收液用乙腈補至4 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，供測定。

1.3.3 標準曲線的配制

標準基質（2 g/kg）：準確稱取瓜爾膠0.2 g（精確至0.000 1 g），置于200 mL燒杯中，加入10 g水，迅速攪拌均勻，然后邊攪拌邊加入空白試樣，補足至100 g，再次均質，配制成2 g/kg的標準基質，臨用現制。

分別稱取標準基質：0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，不足2 g的，用空白試樣補足至2 g（精確至0.01 g），與樣品同時進行酶解凈化，即上機質量濃度為0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL。計算質量濃度時，以標準基質的實際稱量值計算。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量5 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0 min，5% A，95% B；1.0～4.5 min，60% A，40% B；4.6～6.0 min，5% A，95% B。

質譜條件：電噴霧離子源；采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式正掃描；電離電壓3 kV；輔助氣溫度300 ℃；鞘氣溫度300 ℃；干燥氣流量9 L/min；其他參數見表1。

表1 MRM的優化條件Table 1 Optimal MRM MS parameters

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜-串聯質譜方法建立

如圖2所示，質譜峰分別為m/z365.105 16、527.158 45、689.211 36、851.264 83、1 013.317 93、1 175.370 85，共6 個主要峰。在半乳甘露低聚糖分子中，每個結構單元是1 個單糖（甘露糖或半乳糖）殘基，其質量數是162，因此，質譜峰m/z=18+162×n+23，其中n表示單糖數目、23是與低聚糖結合的鈉離子。各峰之間相差162，與已知單元是一個單糖（甘露糖或半乳糖）殘基相符合[16]。

圖2 瓜爾膠酶解產物的高分辨質譜圖Fig. 2 High-resolution mass spectra of enzymatic hydrolysate of guar gum

因酶解物三糖響應較強，且為瓜爾膠的最小結構單元，因此選用527.1（酶解物三糖）用于質譜MRM檢測，其分子式為推斷其結構如圖3所示[35]，推斷其可能的斷鍵機理如圖4所示。

圖3 用于質譜MRM檢測的酶解物三糖的結構信息Fig. 3 Structural information of the trisaccharide in the enzymatic hydrolysate used for mass spectral analysis

半乳甘露低聚糖親水性強，在ZORBAX Eclipseplus C18、Kinetex F5、ZORBAX SB等色譜柱中保留較弱，不能得到良好的峰形。使用HILIC親水柱對其進行色譜分離，比較乙腈+水、乙腈+甲酸（0.1%）、甲醇+水、甲醇+甲酸（0.1%）4種流動相體系對酶解物三糖的分離效果，乙腈+甲酸（0.1%）作為流動相可以得到較好分離度及峰形，對瓜爾膠酶解產物的洗脫程序進行優化）。0～3 min設置為流向廢液部分，這一設定降低了復雜基質的影響，4～4.5 min為酶解物三糖的出峰區間，4.6～6.0 min流動相回到初始比例，并為下一次進樣做準備。

圖4 斷鍵機理推斷示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the mechanism of bond breakage

在豬肉基質中，使用外加標方法加入瓜爾膠，經提取凈化后上機檢測，如圖5所示，酶解物三糖在肉類基質中得到有效分離且響應值滿足實驗要求。

圖5 豬肉的酶解物（a）和添加1 g/kg瓜爾膠的豬肉酶解物（b）三糖MRMFig. 5 MRM Mass spectra of enzymatic hydrolysate of pork without (a) and with 1 g/kg guar gum (b)

2.2 前處理方法

2.2.1 水解方式的選擇

瓜爾膠的水解方式有酶解、酸解、熱解、微波、輻照與超聲等多種方式[36-38]。酶解、酸解的應用最為廣泛，酸解瓜爾膠往往使用濃度大、酸性較強的酸，如鹽酸、硫酸等，酸解后的瓜爾膠直接進入高效液相色譜-串聯質譜檢測，對色譜柱、質譜損傷較大；而酶解條件較為溫和，一般采用弱酸-鹽的緩沖體系，且酶解可以選用具有選擇性的酶，如β-甘露聚糖酶可以酶切β-1,4-D-甘露糖苷鍵，α-半乳糖酶可以酶切α-1,6糖苷鍵。

2.2.2 緩沖溶液pH值

酶解過程主要受酶解溶液的pH值、酶濃度、酶解溫度、酶解時間4 個因素影響。以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖體系，在不同pH值條件進行酶解實驗，探索最佳酶解條件。雖然體系選用弱酸-鹽緩沖體系，但酶解過程中還存在酸水解的情況，因此實驗中同時考察了酸水解的程度，結果如圖6所示，在pH 2.6～6.0范圍內，酸水解程度相近，在pH 6.6～8.0范圍，酸水解程度下降。在pH 2.6～4.0范圍內，酶水解程度最佳，pH 4.6～6.0范圍酶水解程度大幅度下降，在pH 6.6～8.0范圍，β-甘露聚糖酶失去活性，酶水解效率低于酸水解效率。因此，采用pH值為3.6的緩沖溶液。

圖6 緩沖溶液pH值對瓜爾膠水解的影響Fig. 6 Effect of buffer solution pH on the hydrolysis of guar gum

2.2.3 酶解時間

圖7 酶解時間對瓜爾膠水解的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of guar gum

分別以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察酶解時間10 min至20 h的酶解效率，以探索最佳酶解條件。如圖7所示，在7 h前，瓜爾膠酶解速率較快，含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉分別在6～7 h能夠達到酶解平衡，因此酶解時間選用不低于7 h。

2.2.4 加酶量

使用的β-甘露聚糖酶純度不小于98%，酶活力10 000 U/g。以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察加酶量對瓜爾膠酶解的影響，如圖8所示，在加酶量為30 μg時酶解過程即達到平衡，在后續實驗中，保證酶過量，選用加酶量為100 μg進行酶解。

圖8 加酶量對瓜爾膠水解的影響Fig. 8 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of guar gum

2.2.5 酶解溫度

以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察酶解溫度為40～80 ℃范圍的瓜爾膠酶解效率，如圖9所示，在較低溫度時，酶解效率較低，酶解物三糖響應較低；在50～60 ℃范圍，酶解效率較高，酶解物三糖響應較高且較為穩定；在65～80 ℃范圍，β-甘露聚糖酶的酶活力受到影響，酶解效率較低。因此，選用（55±5）℃為酶解溫度。

圖9 酶解溫度對瓜爾膠水解的影響Fig. 9 Effect of temperature on the hydrolysis of guar gum

2.2.6 凈化方式的選擇

樣品在提取過程中雖會去除大部分的脂肪、蛋白等干擾物質，但提取溶液中仍含有大量的雜質，會在后續的檢測過程中產生明顯的基質效應，對于基質效應嚴重的目標化合物的檢測還需進一步凈化。相較于液液萃取等凈化方式，固相萃取柱的凈化方式可以有效保留目標物，除掉多余雜質，而且操作快捷，因此選取固相萃取柱對其進行進一步富集、除雜。

圖10 固相萃取柱對瓜爾膠水解的影響Fig. 10 Effect of solid phase extraction column on the hydrolysis of guar gum

凈化過程中，不同固相萃取柱類型會對目標化合物有不同程度的保留，在實驗過程中，為了得到凈化、富集效果都比較好的結果，考察不同固相萃取柱對酶解物三糖的凈化效果。基于酶解物三糖極性弱、易溶于水，不易溶于有機溶劑的性質，實驗選取HLB、C18、中性氧化鋁柱3種固相萃取柱進行對比。分別取用含0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉的酶解液，經過3種固相萃取柱凈化，結果如圖10所示。結果表明：中性氧化鋁柱作為一種能夠有效去除樣品中脂肪和蛋白質的SPE小柱，能夠明顯降低基質效應，實驗結果表明其對酶解物三糖有較好的凈化效果，因此本方法選取中性氧化鋁固相萃取柱作為凈化小柱。

2.2.7 定容溶劑的選擇

定容溶劑的選擇會影響目標化合物的峰形和離子化效率，因此對定容溶劑進行優化。經過凈化后，溶液為水系，可以增加有機溶劑，以提高目標物的離子化效率，本方法選用乙腈，乙腈不僅可以沉淀蛋白，增加凈化效果，且能與色譜流動相保持一致，可以改善峰形。如圖11所示，分別向含0.3%瓜爾膠的豬肉酶解液中增加乙腈體積分數，并折算相對含量，在乙腈體積分數約為40%～60%之間時，離子化效率好，相對含量最高，且峰形良好。

圖11 定容溶劑對瓜爾膠水解的影響Fig. 11 Effect of amount of acetonitrile added to enzymatic hydrolysate of pork on the hydrolysis of guar gum

2.3 分析特征量

2.3.1 基質效應

基質效應是由與被分析物一起流出的其他內源性物質造成的，例如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等，這些干擾物與目標化合物共同流出，可影響待分析物的霧化、揮發、裂分、化學反應及帶電過程，導致進入質譜的離子減少（離子抑制）或增多（離子增強），從而影響定量結果的可靠性和準確性。

通過繪制溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，按照[（基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）/溶劑標準曲線的斜率]×100評價畜肉的基質效應大小。結果為負表示基質抑制效應，結果為正表示基質增強效應。當基質效應為-20%～20%時為弱基質效應；基質效應為-50%～-20%或20%～50%時為中等基質效應；當基質效應小于-50%或大于50%時為強基質效應。分別繪制質量濃度范圍為0～50 μg/mL的溶劑標準曲線和豬肉、牛肉、羊肉基質匹配標準曲線，酶解物三糖的基質效應由表2可見，3種基質中基質效應在-96.04%～-97.17%之間，此結果表明本實驗的基質效應會對實驗結果產生影響，需通過基質曲線校正基質效應的影響。因此本實驗通過配制基質標準曲線扣除基質帶來的影響。

表2 酶解物三糖的基質效應Table 2 Matrix effect of the trisaccharide

針對豬、牛、羊基質中，評價基質匹配曲線及基質前加標曲線中基質效應的影響，分別使用基質匹配曲線、空白基質加標曲線繪制校正曲線，線性范圍約為0～50 μg/mL，曲線相關系數如圖12a～c所示，空白基質加標的標準曲線與基質匹配曲線相差較大，為能獲得良好的回收率，選用空白基質加標的方式制作標準曲線。因瓜爾膠水溶液為懸濁液，采用懸濁液的方式加標，線性不佳，因此本方法采用配制含瓜爾膠的基質方式制作曲線。

基質前加標標準曲線能夠對前處理過程的影響進行校正，但是由于在實際檢測過程中無法針對每一個基質均制備基質前加標校正曲線，因此其無法完全校正基質效應對目標物的干擾。為考察豬牛羊基質曲線的基質效應影響，選取多種空白基質，配制含瓜爾膠的基質配置標準曲線，結果如圖12d所示，不同基質的標準曲線相差較小，在檢測過程中，可選用某一種基質制備標準曲線。

圖12 不同基質標準曲線Fig. 12 Standard curves of different substrates

2.3.2 線性、檢出限和定量限結果

基質加標標準曲線，分別稱取含2 g/kg瓜爾膠的基質0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g于50 mL試管中，不足2 g的用空白試樣補足至2 g，與樣品共同酶解凈化，即上機質量濃度為0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL，得到酶解物三糖在7 個質量濃度水平下繪制的線性方程及相關系數R2。以3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限及定量限，結果如表3所示。

表3 酶解物三糖的回歸方程、相關系數、檢出限、定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of the trisaccharide in pork, beef and mutton

2.3.3 回收率及精密度結果

瓜爾膠添加水平設定為0.100、0.200、1.00 g/kg。選取3種不同空白基質樣品，分別添加不同質量濃度的標準品，然后按照本檢測方法進行實際檢測，結果如表4所示。實驗結果表明瓜爾膠在0.100～1.00 g/kg添加水平回收率范圍為85.4%～109.8%。相對標準偏差（變異系數）均小于10%。

表4 瓜爾膠在3種基質中加標回收結果Table 4 The recovery rate results of guar gum in three matrices

3 結 論

本實驗建立豬、牛、羊等畜肉中瓜爾膠測定的高效液相色譜-質譜法，樣品經β-甘露聚糖酶酶解，加入乙腈沉淀蛋白后離心，上清液經過中性氧化鋁柱凈化，用液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。該法前處理過程簡單，且方法線性范圍、精密度及檢出限均滿足相關標準的要求，該方法可作為打擊“注膠”畜肉中瓜爾膠的有效技術手段。該方法的建立彌補了當前針對畜肉中瓜爾膠檢測標準的缺失，為打擊“畜肉非法注膠”的不法現象提供了有效的監測手段。

瓜爾膠是甘露糖與半乳糖物質的量比約為2∶1的半乳糖甘露聚糖，但半乳甘露聚糖不僅包括瓜爾膠，還包括甘露糖、半乳糖比例與瓜爾膠相同或不同的膠；甘露糖、半乳糖比例與瓜爾膠相近的有田菁膠、胡蘆巴膠、刺槐豆膠等，這幾種半乳甘露聚糖在β-甘露聚糖酶的作用下同樣可以產生相似的酶解物三糖，但由于畜肉中不允許添加半乳甘露聚糖膠，因此檢出酶解物三糖就有添加半乳甘露聚糖膠的風險，可以用以打擊非法添加；本實驗可以解決已知添加某種膠（如瓜爾膠）時添加量的測定，當添加2種或2種以上半乳甘露聚糖膠時只能計算總量（以某一種膠計算）。