氧化胭脂蟲紅酸用于蘑菇中的鐵離子檢測

劉蘭香，李 想,2，唐保山，譚 瑞,2，徐 涓，馬金菊，張 弘,*

（1.中國林業科學研究院高原林業研究所，國家林業和草原局特色森林資源工程技術研究中心，國家林業和草原局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650233；2.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

鐵是各種生物所必需的微量元素之一，幾乎每一個生化過程中都需要，包括細胞呼吸、細胞增殖、攜帶氧分子的生物合成、核酸的合成和修復以及作為許多其他酶反應的輔助因子[1-3]。研究發現，缺乏鐵會導致多種癥狀貧血[2-4]，同時會引起哺乳動物的神經發育遲緩和認知缺陷[5]，也可能引起局部的病理損傷等[6]。通過食物攝入是補充每日所需微量元素鐵的最簡單而有效的方式，例如，人們頗為喜愛的食物蘑菇中就富含鐵元素。然而，鐵同時具有神經毒性作用，鐵累積會產生活性氧從而導致細胞周期停滯，最終導致細胞死亡[6]。因此，對食物進行微量鐵元素檢測，對于每日合理膳食具有重要的指導意義。目前，電感耦合離子質譜法[7]、電化學分析法[8]、火焰原子吸收法[9-10]等多種檢測方法可以實現食物中微量鐵元素的檢測[11]，這些方法具有靈敏度高、檢測限低、準確度好等優點，但是存在儀器設備昂貴、測試成本高的問題。近年來，基于熒光傳感器的分析方法因其具有較高的選擇性和穩定性，且操作簡單、分析迅速而受到廣泛的關注。

胭脂蟲紅酸是天然染料胭脂蟲紅色素的主要成分，其結構中包含1 個α-糖苷基團和1 個多羥基蒽醌結構（圖1），被廣泛用于食品、藥品以及高端化妝品等領域[12-14]。胭脂蟲紅酸中在水、甲醇、丙酮等溶劑中可發射波長約為600 nm的紅色熒光，在金屬離子檢測、生物蛋白識別、農殘檢測等方面具有較大的應用潛力[15-19]。然而，以胭脂蟲紅酸為熒光傳感器用于分析檢測，存在熒光強度低和靈敏度有待提高等問題，從而限制其實際應用。據報道，芳香族化合物中加入合適的氧化劑在高溫高壓的條件下會發生脫氫氧化以及脫水縮合反應，得到具有更大共軛程度的π-π結構且熒光性能更優異的物質，從而提高其作為熒光傳感器的靈敏度而應用于熒光分析檢測[20-22]。

本研究以胭脂蟲紅酸為原料，高碘酸鉀為氧化劑，通過乙醇/水共混熱溶劑法制備氧化胭脂蟲紅酸（oxidized carminic acid，OCA），然后對其進行結構表征和應用，期望將熒光性能優異的OCA開發為熒光傳感器用于蘑菇中金屬離子的檢測，進一步拓展天然色素胭脂蟲紅酸在熒光分析檢測方面的應用。

圖1 胭脂蟲紅酸的結構式Fig. 1 Structural formula of carminic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇、白菇和杏鮑菇購買于本地超市。

胭脂蟲紅酸（純度≥95%）由中國林業科學研究院高原林業研究所提取和純化；高碘酸鉀 美國Adamas公司；羅丹明B、氯化鈉、亞硝酸鈉、氯化鐵等無機鹽（均為分析純） 天津風船化學試劑科技有限公司；乙醇（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；實驗室用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

AB204-S型精密型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；C-MAGHS-7型磁力攪拌器 德國IKA公司；KOFD1-10/3高壓反應釜 煙臺招遠松嶺儀器設備有限公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；UV-4802S紫外-可見分光光度計（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）尤尼柯上海儀器有限公司；TENSON27型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，FT-IR）儀 德國布魯克光譜儀器有限公司；ST20PH測試筆 奧豪斯儀器有限公司；Nano ZS90動態光散射儀（dynamic light scattering，DLS） 英國Malvern儀器有限公司；Scientific K-Alpha X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）儀、電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國Thermo公司；Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 OCA制備

準確稱取5.0 mg胭脂蟲紅酸于燒杯中，加入6 mL去離子水使其充分溶解后將溶液轉移至高壓反應釜中，并用15.0 mL乙醇洗滌燒杯并轉移至高壓反應釜，然后加入30.0 mg高碘酸鉀，將混合溶液密閉后在180 ℃條件下于馬弗爐中反應1 h。待反應混合溶液自然冷卻至室溫經0.45 μm有機系濾膜過濾，所得濾液即為OCA。

1.3.2 熒光量子產率測定

以熒光量子產率為89%的羅丹明B作為標準參照物，通過測定OCA溶液和羅丹明B溶液在波長336 nm下的熒光發射峰的面積和對該波長光的吸光度，按式（1）計算熒光量子產率[20]：

式中：Ф、S、A分別為OCA的熒光量子產率、熒光發射峰面積及吸光度；ФR、SR和AR分別指參比物羅丹明B的熒光量子產率、熒光發射峰面積及吸光度；η為乙醇/水混合溶劑的折射率1.362 1；ηR為溶劑水的折射率1.332 5。

1.3.3 結構表征

1.3.3.1 FT-IR測定

將15 mL OCA溶液經80 ℃減壓蒸餾2 h，得到干燥的OCA固體粉末。然后，采用溴化鉀壓片法分別將干燥的OCA和原料胭脂蟲紅酸與溴化鉀混合壓片進行測試，掃描波數范圍4 000～400 cm-1。

1.3.3.2 XPS測定

OCA測試用的靶材為Al，Kα，X射線束能為100 W，測試光柵直徑為100 mm，光斑為400 μm。數據分析時，以C1s吸附碳C—C/C—H結合能284.8 eV對所有譜峰進行校準，使用Avantage軟件對XPS數據進行分峰擬合。

1.3.3.3 TEM測定

樣品測試點分辨率為0.24 nm，信息分辨率為0.14 nm，最高加速電壓為200 kV。

1.3.4 環境pH值對OCA熒光性能的影響

分別配制pH 3、5、9、11和13的鹽酸和氫氧化鈉溶液，考察不同pH值溶液對OCA熒光性能的影響。測試時，取1.0 mL不同pH值的溶液與3.0 mL OCA溶液混合15 min，然后超聲15 min后在激發波長為336 nm，光電倍增管電壓（photomultiplier tube，PMT）為700 V的條件下檢測溶液的熒光性能。

1.3.5 離子對OCA熒光性能的影響

準確配制濃度均為1.0 mmol/L的氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鈉、醋酸鈉、亞硫酸鈉、硫酸鈉、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、草酸鈉、磷酸二氫鈉溶液共10種陰離子不同的溶液；氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、氯化亞銅、氯化銅、氯化鋇、二氯化汞、氯化鋅、氯化鎂、氯化鈣、氯化鎳、氯化錳、氯化鉛、氯化亞鐵、氯化鐵、氯化鋁和氯化鉻17種常見的金屬氯鹽溶液。然后，分別準確量取1.0 mL鹽溶液與3.0 mL OCA溶液混合并超聲15 min；同時設置添加1.0 mL的去離子水的樣品為空白樣，將所得樣品在PMT為700 V，激發波長為336 nm條件下進行熒光檢測，考察不同陰離子和陽離子對OCA熒光性能的影響。

1.3.6 抗干擾性實驗

將4.0 mL OCA溶液和1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的氯化鐵溶液混合，然后分別加入1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的其他金屬離子溶液，混合15 min后再超聲15 min，然后在PMT為700 V、激發波長為336 nm條件下測定溶液的最大熒光強度，同時設置空白對照。

1.3.7 OCA檢測Fe3+的工作曲線

準確配制質量濃度為56.0 mg/L的FeCl3儲備液，然后逐級稀釋至質量濃度分別為11.2、22.4、33.6 mg/L和44.8 mg/L。測試時，分別準確量取1.0 mL不同濃度的Fe3+溶液與3.0 mL OCA溶液混合均勻15 min后再超聲15 min，然后將混合液在激發波長為336 nm，PMT為700 V條件下進行熒光檢測。記錄被檢測樣品位于發射波長380～620 nm區間的熒光發射峰積分面積為S，空白樣品為S0。最后，以Fe3+的質量濃度為橫坐標，（S0-S）/S0為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.3.8 OCA檢測Fe3+的應用

將新鮮的香菇、白菇和杏鮑菇分別置于組織研磨機進行粉碎后在105 ℃條件下干燥1 h，然后分別準確稱取50.0 mg樣品置于消化管中，加入2.0 mL硝酸放置1 h，然后進行熱消解。待樣品消解完全后將酸除盡，冷卻后加入10.0 mL水，過濾，濾液轉移至50 mL容量瓶然后用去離子水定容，得香菇（A）、白菇（B1）和杏鮑菇（C1）溶液，將香菇溶液稀釋5、3 倍和2 倍，即得香菇供試品溶液A1、A2和A3；白菇和杏鮑菇溶液分別稀釋2 倍和3 倍，即得白菇供試品溶液B2、B3和杏鮑菇供試品溶液C2、C3。熒光方法檢測時，將1.0 mL供試品溶液與3.0 mL OCA熒光傳感器溶液混合，按照1.3.7節的方法進行熒光檢測。同時，所有供試品溶液進行ICP-MS檢測，以驗證熒光方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 OCA的表征

2.1.1 FT-IR分析

圖2 胭脂蟲紅酸和OCA的FT-IR光譜Fig. 2 FT-IR spectra of CA and OCA

如圖2所示，FT-IR光譜顯示，原料胭脂蟲紅酸其在3 400 ～2 500 cm-1范圍內有一個寬而強的羥基（—O—H）引起的伸縮振動吸收峰，這是由于其分子結構中含有α-糖苷基團；而其氧化產物OCA在3 372 cm-1處的O—H伸縮振動吸收峰明顯變弱變窄，說明與胭脂蟲紅酸相比，OCA結構中的—OH數目減少；同時，OCA在2 921 cm-1和2 858 cm-1處的甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動吸收峰明顯增強；OCA在1 731 cm-1的吸收峰是典型的C＝O伸縮振動，1 196 cm-1和1 100 cm-1處的強吸收峰分別是由C—O—C引起的伸縮振動和彎曲振動，說明OCA中可能含有羰基和酯基，而胭脂蟲紅酸在1 717 cm-1處的C＝O吸收峰是其分子中的羰基和羧基引起的伸縮振動。此外，OCA在1 594 cm-1處的吸收峰是芳香族化合物C＝C的典型伸縮振動，1 373 cm-1和1 337 cm-1處是C—H的伸縮振動，886 cm-1和770 cm-1是芳香族化合物C—H的伸縮振動吸收峰。FT-IR光譜分析結果表明OCA結構中含有苯環、羥基、羰基和酯基等基團[23-24]。

2.1.2 XPS分析

如圖3所示，胭脂蟲紅酸基OCA的XPS圖顯示其在283.6 eV和532.2 eV處分別有C1s和O1s的特征峰，說明OCA主要由C和O元素組成；而在620.5 eV和630.0 eV處有碘元素的3d5和3d3特征峰，這可能是氧化劑高碘酸鉀的無機還原產物摻雜在OCA引起的。C1s分峰擬合表明存在C—C/C—H（284.82 eV）、C—O（286.54 eV）和C＝O（288.81 eV），O1s分峰擬合表明存在C＝O（532.40 eV）和C—O（533.49 eV）。XPS鑒定的OCA組分與FT-IR結果一致，表明OCA的結構具有芳香族化合物的結構，其表面含有羰基、酯基和羥基等官能團，可為金屬離子或者小分子的識別提供位點[25-26]。

圖3 OCA的XPS（A）及C1s（B）、O1s（C）的XPS擬合分峰圖Fig. 3 XPS spectra of OCA and fitted curves of peaks C1s and O1s

2.1.3 TEM和DLS分析

如圖4所示，TEM和DLS測試結果表明OCA呈橢圓形球狀的納米顆粒，粒子分布較為均一，這些微粒的平均粒徑約為（7.5±1.3）nm。這是因為胭脂蟲紅酸分子結構中含有α-糖苷和多羥基蒽醌基團，在強氧化劑高碘酸鉀的作用下，分子中的鄰二羥基的碳碳鍵斷裂，醇羥基轉化成相應的醛、酮和羧酸；進一步，在高溫高壓條件下，醛、酮、羧酸基團脫水縮合并聚合形成納米顆粒，即目標產物OCA[21-22]。

圖4 OCA的TEM和粒徑分布圖Fig. 4 TEM and particle size distribution of OCA

2.2 OCA的光學性質

如圖5所示，UV-vis光譜顯示OCA的最大吸收峰位于225 nm處，這可能歸因于其表面官能團的n→π*躍遷。熒光測試結果表明，OCA的熒光最大激發波長（λEx）和最大發射波長（λEm）分別位于336 nm和445 nm處；在最大發射波長處，OCA的熒光強度為8 989，在室內自然光下，OCA呈淺黃色溶液，在365 nm光照射下發射明亮的藍色熒光。以熒光產率為89%的羅丹明B作為標準參照物，測得OCA的熒光量子產率為5.2%。

圖5 OCA的光學性質Fig. 5 Optical properties of OCA

2.3 環境pH值對OCA熒光性能的影響

圖6 環境pH值對I-CDs熒光性能的影響Fig. 6 Effect of pH on fluorescence intensity of I-CDs

如圖6所示，與空白對照組（pH 7）相比，OCA在酸性環境下熒光發射的最大波長均為445 nm左右，發射范圍位于380～620 nm區間，且熒光強度稍有增強；然而，當其在pH值大于9的堿性環境中，熒光強度顯著降低，熒光發射峰寬度明顯縮小且發射范圍減小至390～605 nm區間。OCA在不同pH值環境中呈現的熒光差異可能是由于其表面有大量酚羥基，該基團在酸性溶液中不會電離，但是在堿性溶液中容易電離導致電荷的分布改變而影響其共軛結構，致使其熒光減弱[27]，因此，當以OCA為熒光傳感器用于檢測時使用的pH值范圍應控制在1～9之間。

2.4 陰離子對OCA熒光的影響

如圖7所示，與空白組相比，所考察的10種常見陰離子對OCA溶液的熒光強度沒有明顯改變，說明OCA在不同陰離子溶液中穩定性良好。

圖7 陰離子對OCA熒光性能的影響（各陰離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 7 Effect of anions on fluorescence intensity of OCA (at anion concentration of 1.0 mmol/L)

2.5 OCA對鐵離子（Fe3+）的選擇性

圖8 OCA對Fe3+離子的選擇性（各陽離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 8 Selectivity of OCA toward iron ions (at cation concentration of 1.0 mmol/L)

如圖8所示，考察蘑菇中常見的17種陽離子對OCA熒光的影響，結果表明，除Fe3+加入后溶液的熒光強度顯著降低外，其他陽離子均未能使OCA的熒光發生明顯的改變，說明所合成的OCA對Fe3+離子具有較高的選擇性[27]。這可能是因為Fe3+離子與OCA的表面酚羥基絡合，在光照條件下二者發生了電子轉移，OCA表面的電子云密度發生變化從而導致其熒光減弱，且這種減弱趨勢與Fe3+濃度有關，因此，OCA對Fe3+具有選擇性。

為了進一步考察其他金屬離子對Fe3+的干擾作用，進行抗干擾實驗。如圖9所示，與空白樣相比，在含有Fe3+的OCA溶液中加入其他金屬離子時并未明顯改變體系的熒光強度，說明OCA對Fe3+選擇性識別的抗干擾性較強，具有開發成為熒光傳感器用于檢測Fe3+的潛在應用。

圖9 其他金屬離子對OCA識別Fe3+的影響（各金屬離子濃度均為1.0 mmol/L）Fig. 9 Effects of other metal ions at a concentration of 1.0 mmol/L on iron ion recognition by OCA

如圖10所示，向3.0 mL OCA溶液中加入1.0 mL濃度為1.0 mmol/L的Fe3+溶液，溶液熒光立即減弱，但隨著二者混合作用時間的延長溶液的熒光強度略有增加，當反應時間至30 min，二者的熒光體系趨于穩定，且穩定時間超過2 h。因此，當以OCA為熒光傳感器檢測Fe3+時，應按照1.3.7節方法將OCA與被測樣品混合15 min，然后再超聲15 min后再進行熒光檢測。

圖10 OCA與Fe3+作用時間對體系熒光強度的影響（PMT為750 V）Fig. 10 Effect of reaction time between OCA and Fe3+ on fluorescence intensity of the system (PMT was 750 V)

2.6 OCA應用于Fe3+的檢測

如圖11所示，OCA溶液中加入氯化鐵溶液后熒光強度明顯降低，且隨著Fe3+質量濃度增加，OCA的熒光強度逐漸減小，但是最大發射峰位置沒有發生改變，說明Fe3+加入后只與OCA表面的基團發生了相互作用而改變電荷分布，但是沒有改變OCA的內部共軛結構，因此，可以開發OCA作為熒光傳感器用于Fe3+的檢測。OCA位于380～620 nm處的熒光發射峰積分面積減小率與Fe3+質量濃度在11.2～56.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系（R2=0.998），對線性擬合可得標準工作曲線方程y=0.549x-0.039，檢出限為2.5 mg/L（RSN=3）。

圖11 不同質量濃度Fe3+條件下OCA的熒光譜圖Fig. 11 Fluorescence spectra of OCA at different concentrations of Fe3＋

基于Fe3+對OCA熒光減弱作用，采用熒光分析法測定香菇、白菇和杏鮑菇的Fe3+含量。如表1所示，與ICP-MS標準方法相比較，基于OCA作為熒光傳感器的熒光檢測方法用于實際樣品中Fe3+的檢測，樣品回收率在95.3%～110.4%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～4.6%之間，表明該方法可用于香菇、白菇和杏鮑菇等蘑菇中Fe3+的含量檢測，方法可靠。

表1 實際樣品中Fe3+的檢測結果（n=3）Table 1 Results of detection of Fe3+ in real samples (n = 3)

3 結 論

以胭脂蟲紅酸為原料，高碘酸鉀為氧化劑，在乙醇/水熱法一步合成水溶性的可發射藍色熒光的OCA，通FT-IR和XPS分析結構表明OCA結構中含有共軛的芳香環結構和大量含氧官能團；TEM和DLS分析結果表明OCA的平均粒徑約為7.5 nm。

光學性質測試結果表明，OCA的熒光最大激發波長為336 nm，最大發射波長為445 nm，發射范圍位于380～620 nm區間；UV-vis測試結果顯示其在波長225 nm處有最大吸收峰；當以OCA為熒光傳感器用于檢測時使用的pH值范圍應控制在1～9之間，且OCA在不同陰離子溶液中穩定性良好。

OCA對Fe3+有良好的選擇性，加入Fe3+會導致其熒光強度明顯降低，位于380～620 nm區間的熒光發射峰積分面積減小率與Fe3+質量濃度在11.2～56.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系，檢出限為2.5 mg/L。應用結果表明，基于OCA作為熒光傳感器的熒光檢測方法用于實際樣品中Fe3+的檢測，樣品回收率在95.3%～110.4%之間，RSD在2.3%～4.6%之間，表明該方法可用于香菇、白菇和杏鮑菇等蘑菇中Fe3+的含量檢測，方法可靠。