超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中24種真菌毒素

丁學妍，邵瑞婷，張涵璐

（北京市食品安全監控和風險評估中心（北京市食品檢驗所），北京 100041）

真菌毒素是霉菌等真菌在其所污染的食品中產生的有毒次生代謝產物，可廣泛污染農作物、食品及飼料等植物源性產品[1]。目前已知的真菌毒素種類已經有400種，主要有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素等，近期的研究也發現在谷物和飼料中出現了一些高污染率的“新興真菌毒素”[2-3]，其中的交鏈孢霉毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等引起了廣泛關注[4]。交鏈孢霉毒素是由交鏈孢霉產生的一類有毒代謝產物，已發現70多種，其中交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢菌酮酸和騰毒素是食品中最常檢測到、污染水平較高、危害較大、最具有代表性的交鏈孢毒素[5-7]。目前，國內外還沒有食品中交鏈孢霉毒素的限量標準和相應的標準檢驗方法[8]，但是在小麥、蔬菜、水果及其制品中均檢出了該類毒素[9-11]。正是由于真菌毒素普遍存在的污染狀況，特別是曲霉菌屬（主要分泌黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）、鐮孢菌屬（主要分泌玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素、串珠鐮孢菌毒素）在糧谷和飼料中高頻的檢出，及對新興毒素的日益關注，都提示真菌毒素對人畜健康存在著潛在的安全風險。已有研究證實，真菌毒素不僅可通過食入、吸入或皮膚接觸進入人體內，具有強毒性、致癌、致畸和致突變等作用，還會通過與人和動物機體內DNA、RNA結合并抑制其合成蛋白質及各種酶類。細胞結構的破壞，抑制了機體的免疫力，引發人類和動物的急性或慢性中毒，損害機體的肝臟、腎臟、神經組織、造血組織及皮膚組織等，會對人畜健康造成極大威脅[12-16]。

牛乳是最古老的天然飲料之一，被譽為“白色血液”，其營養豐富，是人體鈣質的最佳來源，其制品更是成為了大眾餐桌上不可或缺的一員。而真菌毒素在植物性飼料原料中普遍存在污染，有研究通過檢測來源于我國某大型公司的分布于7 省份、9 個奶牛場的精料、國產燕麥、玉米青貯和全混合日糧100余份樣品，結果發現玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏馬毒素及嘔吐毒素均處于嚴重污染水平[17]。2021年，受極端氣象影響原料小麥和玉米的霉菌毒素污染風險顯著增加，這一異常情況的風險直接造成了奶牛中毒素高污染的情況，給奶牛養殖安全帶來嚴重影響[18-20]，造成牛乳中潛在的真菌毒素污染，食入被污染的食品后會對人體造成不可逆轉的危害。雖然多國對真菌毒素最高殘留量進行了限制，但在食品中的限量標準主要集中在谷物、堅果及其制品等類別上，而對于乳及乳制品中真菌毒素的限量要求主要集中在黃曲霉M1上，對其他真菌毒素的限量要求相對缺失[21-22]，目前真菌毒素檢測方法主要有高效液相色譜法[23-24]、液相色譜-串聯質譜法[25-27]、酶聯免疫法[24]和放射免疫法[28]等。大部分檢測方法為單類目標物的測定，對多種毒素同時檢測的能力有限[29]，不能滿足同時檢測多組分目標物的快速檢測要求。而樣品的前處理方法主要以免疫親合柱凈化為主[23,30]，由于免疫親合柱具有較強的選擇性且價格較高，不能滿足不同類別多種毒素的檢測，當下有必要開發和建立快速、高效、高通量的檢測方法，以及時應對突發的食品安全事件，為食品檢測提供高效、準確的技術支撐。故本方法采用基質分散固相萃取的方式進行凈化，以解決此問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸銨（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；甲酸（質譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-葡萄糖苷酸/硫酸酯復合酶 德國默克公司；多功能凈化柱 美國Romer公司；無水硫酸鎂國藥集團化學試劑有限公司；中性氧化鋁 美國CNW公司；PSA、弗羅里硅土、C18美國Agilent公司。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、13C17黃曲霉毒素B1、13C17黃曲霉毒素B2、13C17黃曲霉毒素G1、13C17黃曲霉毒素G2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、13C34伏馬毒素B1、13C34伏馬毒素B2、13C34-伏馬毒素B3、T-2毒素、HT-2霉素、交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素、細交鏈孢菌酮酸標準品 美國ROMER公司；黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A標準品 北京曼哈格生物科技有限公司；α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮標準品 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-TQS質譜儀 美國Waters公司；T10BS25均質器 德國IKA公司；高速冷凍離心機、MAXQ5000恒溫振蕩搖床 美國Thermo Fisher公司；DL1028H超聲波提取儀 德國Banoelin公司；ME203千分之一電子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品配制

精確稱取各類固體標準品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，避光、-18 ℃保存。

精密量取各類液體標準品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各類外標標準儲備溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素、細交鏈孢菌酮酸2 μg/mL，玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇1 μg/mL，伏馬毒素B17 μg/mL，伏馬毒素B2、伏馬毒素B33 μg/mL，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇10 μg/mL，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G20.03 μg/mL，黃曲霉毒素M10.005 μg/mL，赭曲霉毒素A 1 μg/mL，T-2毒素 5 μg/mL，HT-2霉素10 μg/mL的混合外標標準溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各類內標標準儲備溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含13C17黃曲霉毒素B1、13C17黃曲霉毒素B2、13C17黃曲霉毒素G1、13C17黃曲霉毒素G2、13C34伏馬毒素B1、13C34伏馬毒素B2、13C34-伏馬毒素B31 μg/mL的混合內標標準溶液，避光、-18 ℃保存。

準確吸取混合外標標準溶液0.1 mL用乙腈定容至10 mL，配制成混合外標標準中間液，現用現配。

分別吸取混合外標標準中間液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，各加入混合內標標準溶液0.01 mL，用空白基質試樣溶液定容至1 mL，配制成混合標準溶液系列工作液。

混合標準使用液：吸取混合外標標準中間液0.5 mL，混合內標標準溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度線，混勻，備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.01 g）混勻試樣，置于50 mL具塞離心管中，加入混合內標標準溶液0.05 mL，4 mL pH 5.2的乙酸銨溶液，于37 ℃酶解16 h，靜置室溫，加入16 mL乙腈渦旋混勻后，超聲提取20 min，以10 000 r/min冷凍離心10 min，待用。

稱取0.15 g C18+0.15 g多功能凈化柱下層粉末+0.05 g硫酸鎂于10 mL具塞離心管中混勻，隨后加入4 mL提取后的樣液上清液，渦旋振蕩30 s后，5 000 r/min冷凍離心2 min。將全部上清液轉移至干凈的玻璃試管中，于40 ℃氮氣吹至近干。殘留物用1 mL 50%乙腈溶液（體積分數）復溶，渦旋混勻后，過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測。

空白基質試樣溶液：稱取8 個與試樣等量的空白基質試樣，不加入混合內標標準溶液，與試樣同批同法處理，制得空白基質試樣溶液，備用。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度15 ℃；進樣體積10 μL；流速0.3 mL/min；流動相：A為乙腈、B為0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～1 min，10% A，90% B；1～4 min，10%～50% A，90%～50% B；4～6 min，50%～60% A，50%～40% B；6～9 min，60%～80% A，40%～20% B；9～10 min，80%～90% A，20%～10% B；10～12 min，90% A，10% B；12～12.1 min，90%～10% A，10%～90% B；12.1～15 min，10% A，90% B。

1.3.4 質譜條件

采用多反應監測電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）檢測，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔氣流速150 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min，其他質譜條件參數見表1。

表1 24種真菌毒素多反應監測參數Table 1 Mass spectrometric parameters for the twenty-four mycotoxins

續表1

1.3.5 目標物的確證計算

采用超高效液相色譜-串聯質譜屬于低分辨質譜，根據歐盟指令2002/657/EC，規定低分辨率質譜需滿足4 分，即選取1 個母離子（1 分）和2 個子離子（各1.5 分）用來確證化合物。在本實驗方法條件下24種化合物的檢測結果都能夠滿足此要求，符合對目標化合物的確證準則。

本實驗按照儀器條件測定樣品和混合標準溶液，樣品的質量色譜峰保留時間與混合標準溶液一致，且定性離子對相對豐度與濃度相當混合標準溶液的相對豐度一致，則判斷樣品中存在相應的被測物。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑選擇

分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚4種有機溶劑對牛奶樣品中24種化合物進行提取條件實驗。結果表明，甲醇有一定的提取效果，但出現乳化現象，回收率不足40%；乙酸乙酯及叔丁基甲基醚作為提取試劑，乳化現象更為明顯，無法達到提取效果；采用乙腈作為提取溶劑，蛋白沉淀效果明顯，目標物回收率范圍在85%～110%之間，具有顯著的優勢，故本研究選取乙腈作為提取溶劑。

2.2 基質分散劑的確定

牛奶中含有大量脂肪、蛋白、維生素、磷脂等，這些物質對檢測會造成比較大的干擾，故選擇凈化劑時都要考慮到，本實驗選擇多功能凈化柱、PSA、C18、中性氧化鋁、弗羅里硅土作為凈化填料，無水硫酸鎂作為助劑，進行實驗摸索。

分別稱取0.2 g PSA、C18、中性氧化鋁、弗羅里硅土、多功能凈化柱上層粉末、多功能凈化柱下層粉末于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合標準使用液，渦旋振蕩30 s后，以5 000 r/min冷凍離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測，得到24種真菌回收率，見圖1a。結果表明，C18、多功能凈化柱下層粉末對24種真菌毒素都能回收，故主要選擇這2種填料用于樣品凈化的主要填料。

再分別稱取多功能凈化柱下層粉末+C18（0.1 g+0.1 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18（0.15 g+0.15 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18（0.2 g+0.2 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.1 g+0.1 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.15 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂（0.2 g+0.25 g+0.05 g）、多功能凈化柱下層粉末+C18+無水硫酸鎂+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g+0.05 g）于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合標準使用液，渦旋振蕩30 s后，5 000 r/min冷凍離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測，得到24種真菌回收率，見圖1b。結果表明，C18+多功能凈化柱下層粉末+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）對24種真菌有更好的回收率，故在本研究中，選取C18+多功能凈化柱下層粉末+無水硫酸鎂（0.15 g+0.15 g+0.05 g）作為分散基質固相萃取柱。

2.3 定容溶劑選擇

吸取混合外標標準中間液0.05 mL+混合內標標準溶液0.01 mL，分別用50%、80%、100%乙腈溶液（體積分數）稀釋配制成同一濃度混合標準溶液，供儀器檢測，在相同參數條件下，結果如圖2所示，50%乙腈作為定容液可以得到更好分離度且峰形尖銳。故在本研究中，選取50%乙腈作為定容溶劑。

圖1 24種真菌毒素回收率Fig. 1 Effect of matrix dispersant on recoveries of 24 mycotoxins

圖2 以黃曲霉毒素B2為例的離子譜圖Fig. 2 Ion chromatograms of AFB2

2.4 流動相選擇

吸取混合外標標準中間液0.05 mL+混合內標標準溶液0.01 mL，用50%乙腈溶液（體積分數）配制成混合標準溶液，供儀器檢測，對比2 組流動相，分別為乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，在相同參數條件下，結果如圖3所示，乙腈-0.1%甲酸可以更好分離各種物質且峰形尖銳，故選取乙腈-0.1%甲酸作為流動相。

圖3 不同流動相條件下24種化合物的總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatograms of 24 compounds under different mobile phase conditions

2.5 色譜條件的優化

2.5.1 液相色譜條件優化

比較ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同參數條件下，結果如圖4所示，BEH C18色譜柱拖尾現象明顯，且無法實現多種化合物的基線分離；而HSS T3色譜柱的峰形尖銳，且分離效果明顯優于BEH C18色譜柱。故在本實驗中，選擇HSS T3色譜柱。

圖4 不同色譜柱組成條件下赭曲霉毒素A、T2-毒素為例的離子色譜圖Fig. 4 Ion chromatograms of OTA and T2 using different columns

2.5.2 質譜條件優化

采用ESI，不接色譜柱，標準品直接注射狀態下，分別將100 μg/L標準溶液在正離子（ESI+）和負離子（ESI-）模式下進行全掃描以選擇適當的電離方式，結果表明，玉米赤霉烯酮類（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）、細交鏈孢菌酮酸、交鏈孢酚8種真菌毒素在負離子模式下靈敏度較高，其他16種真菌毒素均在正離子模式下靈敏度較高。故本實驗選取正、負離子2種模式。

2.6 方法學實驗

2.6.1 檢出限、定量限與線性范圍結果

分別吸取混合標準中間液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，用空白基質試樣溶液定容至1 mL，配制成混合標準溶液系列工作液，設置進樣量為10 μL，濃度從低到高進樣，超高效液相色譜-串聯質譜分析。在多反應監測模式下，以定量離子峰面積（峰面積比）作圖，得到標準曲線回歸方程。以待測化合物定性離子對的重構離子色譜峰的信噪比不小于3確定方法檢出限，以定量離子對的重構離子色譜峰的信噪比不小于10確定方法定量限，結果見表2。結果表明，24種化合物在線性范圍內線性關系良好，線性相關系數平方（R2）均大于0.985，能滿足定量分析的要求。

表2 24種真菌毒素檢出限、定量限與線性關系Table 2 Limits of detection and quantitation and calibration curves of 24 mycotoxins

2.6.2 樣品的加標回收率

在5.0 g牛奶樣品中加入含有24種真菌毒素標準混合溶液，應用優化好的方法進行提取、凈化分離和確證，回收率范圍為71.0%～123.0%，相對標準偏差均小于10%。結果表明，各化合物在不同添加水平均得到滿意的回收率和較好的方法重復性。以交鏈孢霉單甲基醚、交鏈孢酚、騰毒素為例的離子色譜圖如圖5所示。

圖5 以交鏈孢霉單甲基醚（a）、交鏈孢酚（b）、騰毒素（c）為例的樣品加標離子色譜圖Fig. 5 Ion chromatograms of spiked samples with AME (a),AOH (b) and TEN (c)

3 結 論

通過比對不同提取試劑、基質分散劑、定容液、流動相及色譜柱確定最終實驗條件，采用分散基質固相萃取凈化，建立了牛奶中24種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。與其他文獻相比，該方法檢測通量大，前處理簡便高效，實用性強，可滿足牛奶中24種真菌毒素的快速篩查和定量的要求，已在日常風險監測實驗中得到良好的應用。