兩種不同質地的蓮藕堿溶性果膠組分熱降解規律及流變學差異

段瑞冰，李 潔，劉紀紅，嚴守雷,3,4,*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學理學院，湖北 武漢 430070；3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程中心，湖北 武漢 430070；4.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心，湖北 武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn），屬于多年生蓮科植物，在中國、日本、印度等東方國家作為蔬菜食用，因其具有較高的營養價值、功能特性和宜人的口感而受到消費者青睞。通常將蓮藕分為粉藕和脆藕，粉藕質地粉糯，在烹飪過程中較易煮爛，而脆藕口感較脆，在烹飪過程中較難煮爛。兩種藕具有不同食用方式且價格差異較大，研究它們在烹飪過程中造成質地差異的機制具有重要的理論和應用價值[1-3]。

有研究表明細胞壁完整性是影響蓮藕質地差異的重要因素[4]，但細胞壁成分復雜，較難明確是哪種化合物起重要作用，因此開始逐漸將細胞壁細化。許多研究表明作為細胞壁主要成分的果膠與果蔬的熱加工質地有著密切關系[5-7]。果膠結構在植物種類、成熟階段、不同組織甚至單一細胞壁內都極具差異，目前研究發現果膠包含4 個結構域，分別是：由線性D-半乳糖醛酸通過α-1,4糖苷鍵連接組成的聚半乳糖醛酸區（homogalacturonan，HG），可在C-4處甲酯化，在O-2/O-3處發生乙酰化，根據酯化度可分為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠；由鼠李糖和半乳糖醛酸交替連接作為鼠李半乳糖醛酸一區（rhamnogalacturonan-I，RG-I）的主鏈，由阿拉伯聚糖、半乳聚和阿拉伯半乳聚糖作為側鏈；鼠李糖半乳糖醛酸二區作為最保守的區域，其側鏈的糖種類較多，有L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖；還有由木聚糖半乳糖醛酸組成的木半乳糖醛酸區[8-9]。根據與細胞壁連接的緊密程度和萃取溶劑可以將提取的果膠分為水溶性果膠（water-soluble pectin fraction，WSF）、螯合態果膠（chelate-soluble pectin fraction，CSF）和堿溶性果膠（sodium carbonate-soluble pectin fraction，NSF）。WSF是與細胞壁連接松散的解聚果膠；CSF是與細胞壁通過鈣離子螯合連接的果膠；NSF是通過共價鍵與細胞壁連接最緊密的果膠。有研究顯示3種果膠中占比最大的NSF在果蔬軟化過程中發生了顯著變化[10-11]。流變學特性是果蔬質構研究中的重要分支，包括穩態流變和動態流變。通過穩態流變學實驗可以判定流體類型，通過動態流變學實驗獲得流體的黏彈性特征參數。影響果膠結構與其流變學特性之間關系的因素有很多，內在因素如酯化度、塊狀度和分支度等，外界條件如pH值、鹽離子和溫度等。其中，溫度變化對果膠流變學特性影響的研究大多是在流變學實驗過程中升溫，雖然能與氫鍵、范德華力、離子鍵、果膠鏈熱遷移率、鏈長和分支度等結合分析用于推測果膠結構與性質[12-14]，但在這個過程中始終無法對果膠結構變化進行可視化。

蘆林湖藕和沔城藕分別是典型的脆藕和粉藕。本實驗選取這兩種蓮藕作為實驗材料并提取其NSF。在流變學實驗前先對NSF進行不同溫度處理，然后通過測定單糖含量變化和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析推測兩種藕NSF的一級結構變化，再通過原子力顯微鏡對兩種NSF納米結構變化進行可視化，最后對流變學實驗與結構測定結果結合分析加熱對兩種藕NSF結構的影響，進一步了解蘆林湖藕和沔城藕質構差異的分子機制，以期為探究細胞壁果膠影響果蔬熱加工質地提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩種蓮藕（蘆林湖藕和沔城藕）于2020年12月在湖北省仙桃市采收。經清洗、去皮、切片、打漿和除淀粉后置于-80 ℃保存備用。

間苯基苯酚、三氟乙酸、溴化鉀、四硼酸鈉、乙酸鈉、丙酮、氯濃硫酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、半乳糖醛酸（均為色譜純）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LGJ-30F真空冷凍干燥機 北京松原華興科技發展有限公司；BSA124S分析天平 德國賽多利斯集團；R-210旋蒸蒸發儀 瑞士Buchi公司；E2695高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；722型紫外-可見分光光度計 上海興茂儀器有限公司；Nicolet470 FTIR儀美國尼高力儀器公司；DHR-2流變儀 美國TA公司；Multimode8原子力顯微鏡 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 NSF的提取

參考Liu Gongji等[15]通過分級提取的方法從蓮藕中分離純化NSF。加95%乙醇溶液于85 ℃水浴中加熱20 min除去可溶性糖，然后加入甲醇-氯仿溶液（1∶1，V/V）振蕩1 h除去脂類物質。用丙酮清洗除去有機試劑后，置于45 ℃烘箱中干燥，獲得蓮藕醇不溶性固形物。

向蓮藕醇不溶性固形物中加入0.1 mol/L乙酸鈉溶液于沸水浴中加熱除去與細胞壁連接松散的WSF。加入環己二胺四乙酸在常溫下振蕩6 h除去與細胞壁通過離子鍵連接的CSF。加入0.05 mol/L碳酸鈉溶液（含有0.02 mol/L硼氫化鈉）在常溫下振蕩6 h。透析除去鹽離子，醇沉并凍干，得到NSF，于-20 ℃保存備用。

1.3.2 NSF的熱處理

將溶解于蒸餾水的蘆林湖藕NSF（LN）和沔城藕NSF（MN）等分成4 份，分別在60、80、100 ℃水浴1 h，另一組作為對照組。然后將處理組和對照組透析24 h除去小分子物質，濃縮、醇沉并凍干后，得到8種待測樣品。

1.3.3 單糖測定

用三氟乙酸水解待測樣品，于110 ℃水解4 h，冷卻后加入甲醇，然后用氮吹儀將管中的三氟乙酸吹出，直到管中無酸味。用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液對水解后的樣品進行衍生化[16]。

采用高效液相色譜儀測定。色譜條件：ZORBAX Carbohydrate色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為pH 6.8 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，流動相B為乙腈；等度洗脫：A∶B＝83∶17，流速為1 mL/min；檢測器：紫外可見吸收檢測器。按下式計算糖比值[17]：

1.3.4 果膠含量測定[18]

采用間苯基苯酚-硫酸法測定。將樣品溶于蒸餾水得到1 mL 0.1 mg/mL樣品液，加入6 mL硫酸-四硼酸鈉溶液（四硼酸鈉濃度為0.012 5 mol/L），混勻后置于沸水浴中加熱5 min。冷卻后加入間苯基苯酚溶液，振蕩混勻，在520 nm波長處測定吸光度。使用D-半乳糖醛酸標準品，溶于蒸餾水，制備0、20、40、60、80、100 μg/mL系列標準溶液，測定吸光度并繪制標準曲線。

1.3.5 FTIR測定

將3 mg待測樣品與300 mg KBr混合研磨，壓至半透明的薄片。每個樣品壓3 個片，在4 000～500 cm-1內獲得紅外光譜，光譜分辨率為4。使用Origin 2018軟件作圖，校正基線、歸一化至2 940 cm-1。

1.3.6 原子力顯微鏡測定

樣品溶于蒸餾水，配置5 μg/mL的樣品稀釋液。向新切割的云母片上滴加5 μL樣品稀釋液，在常溫條件下自然干燥后待測。氮化硅懸臂力常數為40 N/m，采用Tapping模式測定，掃描速率為2 Hz。

使用NanoScope Analysis 1.9離線分析軟件處理圖像：首先采用三階多項式擬合進行平滑處理，去除曲面的弓形效應，使用同一組像素閾值；用“partical”模塊提取NSF的高度信息。將圖像導出為TIFF格式，使用Matlab 2018a軟件編碼并進行骨架提取和鏈長計算；為了保證鏈長的可靠性，定義一條完整鏈的高度幾乎相同，確保沒有將多條鏈纏結的結果作為一條鏈計算[19]。

1.3.7 流變學特性測定

將待測樣品溶于蒸餾水中配制成30 mg/mL的待測液，于170 r/min常溫振蕩溶解。完全溶解后在4 ℃條件下過夜使溶液穩定。使用DHR-2流變儀進行流變學測試，選擇60 mm錐板作為夾具，在0.1～1 000 s-1范圍內測定果膠的穩態流變學行為，利用Ostwald-de Waele模型（式（3））計算K和n，公式如下：

式中：τ為剪切應力/Pa；K為稠度系數/（Pa·sn）；γ為剪切速率/s-1；n為流動指數。

根據n值可以將流體分為假塑型流體、膨脹型流體和牛頓流體：n＞1為剪切增稠（膨脹性）；n＜1為剪切稀釋（假塑性）；n＝1為牛頓流體[20]。

動態流變學特性測定：先進行應變掃描確定線性黏彈區，通過線性黏彈區選出合適的應變（0.1%）進行動態掃描，角頻率為0.1～200 rad/s，得到儲能模量（G’）和損耗模量（G’），計算損耗角正切tanδ。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同熱處理后NSF的化學組成變化

由表1、2可知，從兩種蓮藕中提取的NSF都富含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等果膠特征糖，且兩者經加熱后單糖含量都發生了一定變化。如表1所示，MN總單糖絕對含量整體呈減小趨勢，而LN總單糖含量整體呈增大趨勢，這與表3中的果膠含量變化趨勢相似（標準曲線方程：y＝0.009 1x+0.013 1，R2＝0.998）。MN的總單糖含量整體呈減小趨勢可能是因為提取的樣品中非果膠組分如纖維素較果膠耐熱性更強[21]；因此，隨著溫度升高，MN果膠特征糖的總絕對含量減小。LN中葡萄糖絕對含量明顯高于MN，這可能是因為LN中的果膠與纖維素連接更緊密，因為LN中含有更多阿拉伯糖、半乳糖并且具有更多支鏈，這一結構特點使提取過程中更多纖維素隨果膠被提取出來[22]。LN的總單糖含量整體呈增大趨勢也可能與果膠與纖維素的連接方式有關，但是具體原因還不清楚，但是可以確定的是與NSF中其他組分相比，加熱對LN中果膠組分的破壞程度小于MN。由表2可知，隨著溫度升高，LN和MN半乳糖醛酸的相對含量整體呈增加趨勢，阿拉伯糖、半乳糖等RG-I區特征糖的相對含量整體呈減小趨勢，說明RG-I區的水解程度大于HG區。表1顯示總果膠特征糖含量僅占樣品總量的十分之一左右，這是因為三氟乙酸對果膠僅是部分酸水解，因此所測結果均偏低，但這并不影響其變化趨勢[22]。

表1 熱處理MN和LN的單糖絕對含量Table 1 Change in monosaccharide contents of NSF after heat treatment

表2 熱處理MN和LN的單糖相對含量Table 2 Change in monosaccharide proportions of NSF after heat treatment

表3 熱處理MN和LN的果膠相對含量Table 3 Change in pectin proportion of NSF after heat treatment

2.2 不同熱處理后NSF果膠組分FTIR分析

圖1 熱處理的MN（A）和LN（B）的紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

將紅外光譜與單糖含量結合分析，進一步表征溫度處理對LN、MN一級結構的影響。如圖1所示，3 440 cm-1處為—OH的伸縮振動，2 940 cm-1處為甲基和亞甲基的C—H伸縮振動；在1 730 cm-1波數附近沒有出現峰，說明提取的NSF不含或者含有非常低的甲酯基，這可能因為酯基在NSF提取過程中被皂化[23]；1 620 cm-1處為未酯化的羧基，1 340 cm-1處為C—H彎曲振動，1 240 cm-1處為C—O伸縮振動，1 140 cm-1附近為C—O—C伸縮運動，1 100 cm-1處為C—C和C—O伸縮運動[24-25]。前人研究觀察了不同化合物在1 000～1 200 cm-1區域的峰型，發現富含糖醛酸如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸的樣品在1 100 cm-1和1 018cm-1處出現了兩個強烈峰，且NSF與其他組分相比在1 099 cm-1和1 018 cm-1處有明顯的峰[26]，這在本實驗中也得到了證實。由圖1可知，1 015～1 100 cm-1或1 020～1 150 cm-1處的峰歸為游離半乳糖醛酸；950 cm-1處可能是RG-I分子的特征峰[27]。

由圖1可知，不同溫度處理后的LN和MN在指紋區的峰幾乎重合但是其吸收峰強度發生變化，這說明加熱沒有生成新的化合物但是對果膠化學組分含量的變化有影響。與LN的對照組相比，LN處理組在指紋區的吸光度明顯較大，但是MN與其相反，這可能說明加熱后LN中果膠絕對含量增加，而MN減小，這與表1和表3的結果一致。除此之外，MN在950 cm-1處的峰強度明顯高于LN，說明MN中RG-I區的相對含量多于LN。表2也顯示MN中的阿拉伯糖和半乳糖的相對含量比LN中多，這可能與流變學實驗中MN經加熱后假塑性增強而LN減弱有關。

2.3 不同熱處理后NSF果膠原子力顯微鏡圖像分析

圖2 熱處理的MN和LN的原子力顯微鏡圖Fig. 2 Atomic force micrographs of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

圖3 不同骨架長度果膠鏈/聚集體的相對含量Fig. 3 Relative contents of pectin chains/aggregates with different skeleton lengths in raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

圖4 MN（A）和LN（B）的鏈高比例Fig. 4 Proportions of chain height of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

由圖2～4可知，與對照組比，處理組都出現了鏈長變短、鏈高和分支度降低的現象。如圖2所示，NSF在云母片上形成分支結構，這與已報道結果一致[28-30]。其中LN更類似于星型結構（具有長分支），而MN相對分支較少，多為直鏈結構，結合單糖的相對含量猜測這些短直鏈可能不僅是聚半乳糖醛酸鏈，也有可能是中性糖鏈。LN和MN的鏈長主要集中在50～100 nm之間（圖3）；LN最長138 nm，最短16 nm；MN最長130 nm，最短22 nm，這與已報道的結果接近[31]。圖4表明經加熱后LN和MN的鏈高均降低，且LN的鏈高普遍比MN高；單個半乳糖醛酸分子的高度大約在（0.51±0.25）nm[32]，然而在LN和MN中均發現有高于1 nm的果膠鏈。有研究表明具有螺旋結構的單一果膠鏈的鏈高在1 nm左右[33]，在圖5和圖2C1中均有兩條果膠鏈平行排列的現象，猜測可能是兩條鏈的疊加經加熱后被分開，但是具體兩條鏈以何種方式結合尚不清楚。有許多研究顯示NSF具有規則的連接網絡[31]，但是在本實驗中幾乎沒有觀察到，所有的果膠鏈都呈隨機分布，這為NSF的納米結構提供了新觀點。除此之外，每張圖像上都存在一些聚集體，這些聚集體可能是由果膠鏈纏繞形成，這在櫻桃、草莓及未成熟番茄果皮的NSF中也觀察到[34-36]。

圖5 LN60原子力顯微鏡三維圖Fig. 5 Three-dimensional atomic force micrograph of NSF from crunchy lotus rhizome heated at 60 ℃

LN和MN隨著加熱溫度的升高都出現了鏈寬增大的現象（圖2），這可能是因為探針增寬效應，由于原子力顯微鏡的局限性，當AFM尖端的半徑大于被測量分子的直徑時，分子的圖像與尖端輪廓易混淆，測定尺寸可能偏大[37]；也可能是經加熱后果膠鏈結構變松散的結果，例如雙果膠鏈的松散堆積。

2.4 不同熱處理后NSF果膠流變學特性分析

流變學性質與分子結構具有密切關系，同時也是果蔬質構研究的重要分支，通過測定流變學特性可以表征和驗證結構測定結果。如圖6A和表4所示，從穩態流變學分析中可以看到所有樣品的黏度都隨剪切速率的增加而降低，流動行為指數n均小于1，因此樣品都呈假塑性流體。n值越小表示假塑性越強，K值越小表示黏稠度越小。由表4可知，LN對照組的黏稠度大于MN對照組；圖3和圖4顯示LN的鏈長和鏈高大于MN，且LN中100～200 nm的鏈長占比大于MN；除此之外，MN的HG大于LN（表2）；因此，結合結構分析認為黏稠度與鏈長、鏈高呈正相關，與HG呈負相關。Zdunek等[38]通過研究梨果皮細胞壁的NSF發現半乳糖醛酸含量與硬度呈負相關，這與本研究結果一致。這可能是β-消除反應引起的鏈長變短和游離羧基比重增加，導致分子間斥力增加，從而阻礙了果膠鏈之間的相互作用產生的結果[39]。由表4可知，經加熱后兩者的黏稠度都明顯下降，令人意外的是MN的假塑性略有增加而LN的假塑性減小。結合結構分析認為LN假塑性減小可能是LN鏈長變短、分子質量減小的結果，因為分子質量越大其形變松弛時間越長，較小的剪切導致的形變松弛來不及恢復，在更低的剪切速率下出現了剪切稀釋[39]；除此之外，也有可能是分支度減小的結果。MN假塑性增加可能是分子質量分布變寬所致，有研究表明分子質量分布越寬，假塑性越強[40]；由圖5也可以看到，MN除了含有大量短鏈外也包含數量較少的長鏈，但是關于為何這些長鏈在熱處理過程中沒有被水解為短鏈還需進一步研究。

圖6 熱處理LN和MN的穩態（A）和動態（B～D）流變學行為Fig. 6 Steady (A) and dynamic (B, C and D) rheological behaviors of raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

表4 熱處理LN和MN的冪律模型參數Table 4 Power law model parameters of raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

圖6B、C、D均為動態學流變行為，G’＞G’和tanδ＞1表示果膠呈黏性行為，G’＜G’和tanδ＜1表示果膠呈彈性行為[41]。由圖6B可知，所有樣品的tanδ值均隨角速率的增大而增大，說明在剪切行為下樣品均從彈性狀態轉化為黏性狀態。MN100最為特殊，在低剪切速率下，其tanδ值很小，甚至小于MN對照組，但是隨著剪切速率增加，tanδ值又迅速增大并且是所有樣品中最大的tanδ值，這與MN100假塑性最強的分析結果一致。低剪切速率下，低tanδ可能是因為梳形分子（具有短支鏈）增多，當兩種分子的分子質量接近時，短分支的分子在剪切作用下更易形成凝膠[42]；另一種可能是MN中同時含有較多的短直鏈與長鏈（圖3），這一特殊現象有利于凝膠的形成，但是隨著剪切速率的增加，分子結構受到的破壞大于相互作用，因此最終呈黏性狀態。此外，同樣鏈長變短的LN卻沒有出現與MN100相似的現象，這是因為兩者結構上存在差異；而從圖2D2中能夠看到LN100更接近一種聚集體而非長鏈，這種聚集體不利于分子之間的相互作用，因此其始終呈黏性狀態。

3 結 論

通過系統研究熱處理對來自蘆林湖藕和沔城藕的NSF一級結構、納米微觀結構和流變學特性的影響，深入探討了不同溫度對LN和MN的結構影響以及兩者之間的熱降解差異。結果表明，LN中果膠的RG-I區相對含量比MN高，從原子力顯微鏡圖像中也能看到LN具有較多的長支鏈，而MN多為短直鏈，這一結構差異可能是導致加熱后LN中果膠絕對含量增加而MN減小的重要原因；相同點是兩者的支鏈水解程度大于直鏈。LN和MN經熱處理后均出現了鏈長變短、鏈高降低、分支度減小的現象。結合流變學分析得到，鏈長、鏈高、分支度與黏稠度密切相關。MN假塑性增強而LN減小，這可能與鏈長分布和HG有關，鏈長分布范圍越寬，假塑性越強，支鏈水解程度大于直鏈而導致分子結構從星型狀轉化為梳狀也可能是重要原因。本研究為果蔬熱加工質地差異和NSF結構提供了一定理論依據。