基于自由基介導的酚酸-柑橘果膠接枝共聚物制備及其理化特性

楊鵠雋，左 鋒,2,*，王 坤,3，許馨予，張慧敏,3，賈 斌,2

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

果膠是一種來源廣泛、成本價低的天然植物多糖，其凝膠性、乳化性和乳化穩定性良好，已廣泛應用于食品工業中，不僅可作為食品添加劑，還是益生元、膳食纖維及脂肪替代物等功能性食品的主要成分[1-2]。柑橘果膠是果膠應用中最為廣泛的一種，主要從柑橘屬的果皮中提取出來。柑橘果膠是FAO/WHO食品添加劑聯合委員推薦的安全的天然食品添加劑，且不限定其每日允許攝入量[3]。然而，由于天然柑橘果膠分子質量較大、分子內和分子間氫鍵的相互作用，其溶解度較低，不易被人體吸收利用，導致生物利用率極低[4]。

通過修飾果膠分子鏈上的羥基，可得到具有獨特理化性質和生物活性的果膠衍生物[5]。目前，果膠的改性方法包括pH值法、酶法、超聲法、接枝法[6-9]等。其中，pH值法、酶法、超聲法等存在操作復雜、成本昂貴以及對環境不友好等問題，導致其使用具有一定局限性。通過碳二亞胺化學交聯法、酶催化接枝法、電化學法、超聲輔助法和自由基介導法制備果膠接枝共聚物，因其操作簡單、適用范圍廣、生物活性多樣而被認為是改善果膠理化性質和功能性最有效的途徑之一并且已逐漸成為國內外學者研究熱點。Pasanphan等[10]通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽介導將沒食子酸接枝到殼聚糖上，從而使殼聚糖的溶解性和抗氧化活性有所提高。Karaki等[11]通過合成的酶將阿魏酸氧化接枝于果膠上，引入阿魏酸實體增強其疏水性和抗氧化活性。Ryu等[12]利用電化學方法形成殼聚糖-鄰二苯酚共聚物，從而提高殼聚糖的生物活性。因此，接枝改性可以改善多糖的結構、理化性質，并且根據接枝物的不同擴展其生物活性[10-12]。

酚類物質作為次生代謝產物，在自然界含量最為豐富，廣泛存在于植物界中，如水果、蔬菜、谷類、橄欖和茶葉等[13]。酚類物質作為人類膳食的重要組成部分，具有多種生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和免疫調節活性等[14]。在近幾年的研究中，自由基介導接枝法因具有經濟、環保、安全以及可避免酚酸在反應過程中的降解和氧化等優點，已成功用于許多多糖-酚酸接枝共聚物的制備，如殼聚糖-咖啡酸、殼聚糖-阿魏酸、普魯蘭-阿魏酸[9,15-16]等。然而，基于自由基介導的接枝法對酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的合成和結構研究甚少。

本研究以天然果膠為聚合骨架，采用自由基介導的接枝方法制備酚酸-柑橘果膠接枝共聚物；對改性前后的理化性質進行對比分析；利用傅里葉變換紅外光譜和掃描電子顯微鏡對酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的結構進行表征，以改善柑橘果膠溶解性，拓寬其在食品領域中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘果膠 河南佰卓果膠生物科技有限公司；福林-酚、碳酸鈉、溴化鉀、NaOH、香豆酸、VC、H2O2溶液、醋酸溶液、氮氣、無水乙醇（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TE-124分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TE-124 pH計 北京同德創業科技有限公司；Scientz-10N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色譜儀、Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀、S4800掃描電子顯微鏡、TG-DTA-LR型綜合熱分析儀 上海眾路實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 改性柑橘果膠的制備

參考濮慧敏[15]的方法并略有修改。稱取5.0 g果膠完全溶解于1%醋酸溶液中，加入0.150 mol/L VC溶液和1 g酚酸（沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、龍膽酸），攪拌均勻后調節溶液pH值至6.0。通氮氣60 min，加入0.075 mol/L H2O2溶液啟動反應。氮氣下持續反應1 h，透析72 h，冷凍干燥。為去除未接枝的酚酸聚合物，將凍干后的反應產物用乙醇索氏抽提8 h，再用去離子水透析并凍干。

1.3.2 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的接枝度測定

根據福林-酚法[16]進行測定。取4 mL用蒸餾水配制的0.1 mg/mL樣品溶液于試管中，加入1 mL 0.2 mol/L福林-酚試劑，混勻后，加入3 mL Na2CO3溶液，振動搖晃2 h。于4 000 r/min離心8 min，在760 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。將0.1 mg/mL的5種酚酸溶液稀釋成不同質量濃度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）的標準溶液，繪制標準曲線。根據標準曲線計算酚酸-柑橘果膠接枝共聚物中酚酸的質量濃度。按式（1）計算酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的接枝度：

1.3.3 柑橘果膠分子質量的測定

使用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法[16]測定。準確稱取2 mg樣品，加水溶解，經過0.22 μm水相濾膜過濾后進行色譜分析。GPC條件：RI高效液相色譜檢測器；流動相為0.1 mol/L NaNO2溶液；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃。配制標準溶液：分別稱取不同分子質量的多糖標準品各2 mg，根據其在GPC色譜圖上的保留時間與其對應分子質量的對數（lgmw）作出相應的標準曲線。

1.3.4 柑橘果膠酯化度的測定

參考Wang Chun等[17]的方法。準確稱取50 mg樣品，在錐形瓶中用乙醇潤濕，加入水使樣品全部溶解，加入2 滴酚酞指示劑，使用0.02 mol/L NaOH標準溶液進行滴定，記錄所消耗的NaOH標準溶液體積（V1）。加入20.00 mL 0.5 mol/L NaOH標準溶液，振蕩混勻，加入等質量的HCl標準溶液，振蕩搖勻。然后加入酚酞指示劑，再次用0.02 moL/L NaOH標準溶液滴定至變色，記錄所消耗的NaOH標準溶液體積（V2）。按照式（2）計算柑橘果膠的酯化度：

1.3.5 柑橘果膠中半乳糖醛酸含量的測定

參照Kumar等[18]的方法繪制標準曲線：配制0.1 g/L半乳糖醛酸溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL半乳糖醛酸溶液于25 mL離心管中，加入蒸餾水至1 mL。冰浴預冷，加入6 mL 18.4 mol/L濃硫酸，振蕩搖勻后在冰水浴中冷卻，再加熱20 min，冷卻至室溫。分別加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑-乙醇溶液，混勻后于暗處靜置30 min，在526 nm波長處測定其吸光度。以蒸餾水作空白，半乳糖醛酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程。

柑橘果膠半乳糖醛酸含量測定：取0.1 g柑橘果膠樣品溶于蒸餾水定容至100 mL。取1 mL樣品溶液于25 mL離心管中，同上述操作，在526 nm波長處測定其吸光度。根據標準曲線計算柑橘果膠中半乳糖醛酸含量。

1.3.6 柑橘果膠溶解度的測定

參照Kumar等[18]的方法。取0.5 g樣品，加入50 mL蒸餾水，室溫下攪拌直至混勻。25 ℃、4 200 r/min離心25 min，取上清液至恒定質量的鋁盒中，置于90 ℃的水浴鍋中蒸干，再于105 ℃烘干箱中烘至質量恒定。按式（3）計算柑橘果膠的溶解度：

式中：m1為上清液烘干至質量恒定后與鋁盒的總質量/mg；m2為鋁盒質量/mg；m3為上清液質量/mg。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜測定

采用壓片法[17]進行測定。按質量比1∶100將樣品與溴化鉀混合進行壓片，在4 000～500 cm-1波數范圍內掃描。

1.3.8 柑橘果膠微觀結構的觀察

參照Kumar等[18]的方法。將樣品粘在導電膠上，進行噴金處理。在放大50、1 000 倍、掃描電壓10 kV條件下，用掃描電子顯微鏡觀察其微觀空間結構。

1.3.9 柑橘果膠的單糖組成測定

參照Khatkar等[19]的方法配制標準單糖混合溶液。樣品與450 μL 0.3 mol/L NaOH溶液混合置于離心管中，加入50 μL 1.6 mmol/L乳糖和450 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（甲醇作溶劑）混勻。于70 ℃水浴中反應30 min，用0.3 mol/L HCl溶液調節至pH 7。加入1 mL氯仿萃取，重復2 次，過0.45 μm水膜。

稱取3 mg果膠樣品于安培瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氯乙酸，充氮氣封管。置于110 ℃烘干箱中水解8 h，冷卻至室溫。氮氣吹干三氯乙酸，用1 mol/L NaOH溶液調節pH 7，再用超純水定容至1 mL。取400 μL樣品進行衍生化。

高效液相色譜條件：Dionex CarboPac PA20離子色譜柱（150 mm×3.0 mm）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相為0.1 mol/L NaOH溶液，流速0.5 mL/min；紫外檢測波長為250 nm。通過標準曲線計算樣品中單糖含量。

1.3.10 柑橘果膠的熱重分析和差示掃描量熱分析[16]

取10 mg剪碎的膜樣品置于坩堝內，在4 mL/min的氮氣流中，以空坩堝做對照，用綜合熱分析儀進行測試。熱重分析參數：測試溫度范圍0～800 ℃，升溫速率20 ℃/min。差示掃描量熱分析參數：測試溫度范圍0～800 ℃，升溫速率10 ℃/min；記錄熱重和差示掃描量熱曲線。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的接枝度分析

表1 不同酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的接枝度Table 1 Grafting degrees of different phenolic acid-citrus pectin copolymers

由表1可知，在自由基誘導的接枝反應中，柑橘果膠與5種酚酸均可發生接枝反應形成酚酸-柑橘果膠接枝共聚物，但其接枝度差異顯著（P＜0.05）。這是由酚酸與柑橘果膠接枝部位的羥基含量不同，以及氧化還原體系對酚酸的降解程度不同所致[20]。5種酚酸中，丁香酸的羥基含量最高且丁香酸羥基受自由基作用脫氫氧根的程度最好[21]，所以丁香酸-柑橘果膠的接枝度最高，為（74.2±1.38）mg/g，其次是龍膽酸-柑橘果膠，其接枝度為（67.24±1.55）mg/g。因此，選擇丁香酸-柑橘果膠和龍膽酸-柑橘果膠為后續實驗樣品。

2.2 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的分子質量分析

圖1 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的分子質量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由圖1可知，接枝改性后，酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的分子質量高、分散性指數降低，且分子質量分布向均一性轉變。與原果膠分子質量相比（（109.98±0.05）kDa），接枝改性后的柑橘果膠分子質量明顯下降，龍膽酸-柑橘果膠的分子質量降低至（65.11±0.02）kDa，丁香酸-柑橘果膠的分子質量最低，為（39.83±0.05）kDa。這是由于自由基介導接枝反應過程中產生的自由基奪取了果膠內的氫原子，氫鍵作用力減弱，導致柑橘果膠分子的主鏈或支鏈斷裂，使改性后的果膠形成較小的分子片段，從而降低了分子質量[11]。Wei Zihao[22]和Woranuch[23]等使用自由基介導接枝合成酚酸-殼聚糖接枝共聚物，發現酚酸-多糖接枝共聚物的分子質量比殼聚糖低，與本研究結果一致。

2.3 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的酯化度、半乳糖醛酸含量、溶解度分析

圖2 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的酯化度（A）、半乳糖醛酸質量分數（B）和溶解度（C）Fig. 2 Esterification degrees (A), galacturonic acid contents (B) and solubility (C) of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由圖2可知，與原果膠相比，接枝改性果膠的酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度均有所增加。原果膠酯化度為（51.62±1.46）%，屬于高甲氧基果膠（酯化度＞50%），龍膽酸-柑橘果膠酯化度增加至（70.83±1.64）%，丁香酸-柑橘果膠酯化度增加至（72.73±2.18）%。這主要是由于H2O2體系在反應過程中產生的自由基奪取了果膠內的氫原子，接枝后酚酸的羧基脫去氫氧根后，與原果膠脫氫的羥基發生酯化反應形成甲酯基，導致接枝物中甲酯基增多，使接枝共聚物的酯化度升高[24]。

由圖2B可知，相比于原果膠（半乳糖醛酸質量分數為（39.18±1.08）%），改性后的龍膽酸-柑橘果膠半乳糖醛酸質量分數增加到（52.42±1.36）%，丁香酸-柑橘果膠半乳糖醛酸質量分數增加到（53.88±1.19）%。這可能是由于改性過程中多聚糖醛酸解聚以及脫除了中性糖及部分雜質，從而導致半乳糖醛酸含量的增加[19]。

由圖2C可知，接枝改性后的果膠溶解度比原果膠的溶解度增加了約20%，由（39.34±1.08）%分別增加至（54.40±1.05）%和（59.87±1.21）%，這主要是由于接枝改性過程中自由基奪取了果膠內的氫原子，使氫鍵作用力減弱、疏水性減小、溶解度增加[21]。

結合圖1可知，隨著接枝改性后果膠分子質量下降，接枝改性果膠的酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度都有所增加。Samuels[25]的研究發現，接枝改性后的果膠分子質量通常與酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度呈負相關，酯化度、半乳糖醛酸含量與溶解度呈正相關，與本研究結果一致。

2.4 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由圖3可知，與原果膠相比，不同種類的酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的峰形相似，說明改性柑橘果膠的糖類型未改變，改性前后的基本結構未發生明顯變化。在3 450 cm-1波數附近的寬吸收峰來自—OH和—NH2的不同強弱的分子內或分子間的O—H伸縮振動；2 930 cm-1波數處的吸收峰為多糖C—H伸縮振動，包括—CH、—CH2、—CH3內的伸縮振動[22]；1 740 cm-1和1 625cm-1波數處是果膠的特征峰，分別為酯化的羧基官能團吸收峰和自由羧基官能團吸收峰。1 740 cm-1波數處的特征峰可用于區分果膠酯化度的高低。由圖3可知，相比于原果膠，接枝改性果膠在1 740 cm-1波數處的吸收峰增強，說明改性后的柑橘果膠酯化度升高，與圖2一致。此外，接枝改性后，果膠圖譜中1 420 cm-1波數處（—CH2彎曲振動）的吸收峰明顯減弱，表明C-6位的—CH2消失，證明C-6位可能為果膠的反應活性位點[26]。另外，接枝改性果膠在1 510 cm-1和1 360 cm-1波數處出現了新的吸收峰，分別為酚酸芳香環的C＝C拉伸以及新C—N共價鍵的生成[27]。這些結果也說明酚酸與柑橘果膠接枝成功，并且酚酸主要以共價形式接枝到果膠鏈上。

2.5 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的掃描電子顯微鏡分析

圖4 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物放大500 倍（A）和1 000 倍（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of pectin and phenolic acidcitrus pectin copolymers at × 500 (A) and × 1 000 (B) magnification

由圖4可知，原果膠顯示出相對粗糙且致密的塊狀結構，表面呈現內凹型、部分團聚、質地較厚；經酚酸接枝改性后果膠表現出片狀結構，其表面相對光滑、質地較薄、松散且部分卷曲。接枝過程中，在自由基的作用下柑橘果膠分子間與分子內部的氫鍵作為連接作用被極大減弱，可能導致接枝改性后的果膠形態發生了明顯變化。

2.6 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的單糖組成分析

表2 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由表2可知，柑橘果膠原料分子中的主要包括葡萄糖、半乳糖醛酸，鼠李糖、半乳糖和甘露糖等9種單糖。接枝改性沒有改變柑橘果膠的單糖種類，但使其單糖含量發生一定變化。接枝改性后，除了葡萄糖和甘露糖含量降低外，其余單糖含量均有所增加。半乳糖醛酸含量從3.39%分別增加到28.91%和30.19%，這與圖2中半乳糖醛酸含量變化趨勢一致，這也說明在自由基介導的酚酸改性過程中，柑橘果膠的半乳糖醛酸主鏈不易被降解[28]。此外，接枝改性后，葡萄糖和甘露糖含量降低主要是自由基使柑橘果膠分子的葡萄糖或甘露糖之間以及與半乳糖醛酸之間的連接被打斷，被降解成寡糖并在透析過程中被除去所致[29]。

2.7 酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的熱分析

由圖5A可知，樣品的熱解過程可分為以下階段[30-31]：第1階段（100～200 ℃）有一個小的質量損失過程，主要損失的物質為原果膠及接枝共聚物中的結合水和結晶水，此過程為吸熱反應；第2階段在200～400 ℃，為原果膠和接枝共聚物的主要降解階段，可以看出柑橘果膠受熱分解導致質量的快速損失，半乳糖醛酸鏈首先開始大量熱降解，糖苷鍵被打斷；第3個階段（400～800 ℃）是由柑橘果膠碳骨架的降解所引起，當溫度達到800 ℃，原果膠、龍膽酸-柑橘果膠和丁香酸-柑橘果膠中殘留的灰分比重分別是11.75%、22.64%和38.60%，表明樣品降解速率為原果膠＞龍膽酸-柑橘果膠＞丁香酸-柑橘果膠。此外，圖5B中的峰代表樣品的最大分解速率，原果膠、龍膽酸-柑橘果膠和丁香酸-柑橘果膠的最大分解速率對應的溫度分別是325、265 ℃和255 ℃。這些結果表明，酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的熱穩定性比原果膠差。Pasanphan等[10]在制備殼聚糖衍生物的研究中發現，沒食子酸接枝到殼聚糖上會使原本殼聚糖結構鏈的排列方式發生變化，導致其熱穩定性下降，與本研究結果一致。

圖5 原果膠及酚酸-柑橘果膠接枝共聚物的熱重（A）和差示掃描量熱曲線（B）Fig. 5 Thermogravimetric (A) and differential scanning calorimetric curves (B) of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

3 結 論

通過VC/H2O2氧化還原體系將5種酚酸接枝到柑橘果膠的分子鏈上，形成酚酸-柑橘果膠接枝共聚物，其中丁香酸-柑橘果膠接枝度最高，為（74.2±1.38）mg/g，其次為龍膽酸-柑橘果膠接枝度，為（67.24±1.55）mg/g。與原果膠對比發現，自由基介導接枝反應過程中產生的自由基奪取了果膠內的氫原子，使酚酸接枝改性后的柑橘果膠分子質量下降并向均一性轉變，而酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度增加，其中，使用龍膽酸和丁香酸接枝改性后的果膠溶解度比原果膠的溶解度增加了約20%，由（39.34±1.08）%分別增加至（59.87±1.21）%和（54.40±1.05）%。接枝反應過程中，酚酸主要以共價形式接枝于柑橘果膠鏈上，且并未破壞柑橘果膠的主要化學結構，使其微觀結構形成更加光滑平整的片狀結構，但酚酸接枝改性后柑橘果膠的熱穩定性低于原柑橘果膠。