南極磷蝦原肌球蛋白純化鑒定、理化特性及模擬表位肽預測

王 珊，劉 瑤，劉柯欣，張書琪，林松毅,2,3，孫 娜,2,3,*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）存在于除植物以外的所有真核細胞中[1]，被證明是一種交叉反應過敏原[2]，在無脊椎動物家族中被認為是泛變應原[3]，在蝦等多個物種中被確定為主要過敏原[1]。它是一種高度保守蛋白，平均長度約為284 個氨基酸殘基，由兩個平行的α-螺旋組成，分子質量約34～38 kDa[1]。TM是引起食物性過敏反應的第三大常見原因[4]。據報道，80%以上的蝦類過敏反應均由TM引起[5]，且小劑量TM就足以引發嚴重的全身性臨床過敏癥狀[6]。然而，引起過敏癥狀發生的并非整個蛋白質分子，而是其包含的一些抗原表位[7]。現階段已有兩種蝦類的TM過敏原表位被識別并證實為特異性IgE結合區域[8]，公布于過敏蛋白結構數據庫中[9]。南極磷蝦是一種生物資源量巨大且綠色、天然的優質蛋白來源[10]。但目前我國對于南極磷蝦蛋白的相關研究剛剛起步，對其開發利用尚不充分[11]。Motoyama等[12]通過血清學相關實驗證實了南極磷蝦TM是其主要致敏原，不過目前進一步對其特異性IgE結合表位的識別及結合能力的相關研究還近乎空白。因此，有關南極磷蝦TM過敏原表位的深度挖掘對于其致敏性相關研究尤為重要。

表位也被稱為過敏決定簇，是過敏原表面的特殊化學基團，可與抗體或抗原受體發生特異性結合[13]。表位通常由8～26 個氨基酸組成[13]，分為線性表位和構象表位兩種。目前對于TM的致敏表位研究主要集中在線性表位上[14]。近年來，生物信息學技術不斷發展進步，憑借其方便快捷、準確性高、成本低等諸多優點已逐步成為評估預測過敏原表位的有效手段[15]。Zheng Lina等[7]利用生物信息學技術成功預測出斑節對蝦TM的8 條線性過敏原表位。Fu Linglin等[16]也通過生物信息學工具預測識別了中國對蝦TM的12 條潛在過敏原表位。

本研究以南極磷蝦（Euphausia superba）為主要研究對象，通過除肌漿蛋白、丙酮除脂、蛋白粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多個步驟對其進行提取純化；利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和超高效液相色譜-串聯質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術對目的蛋白進行相關鑒定；對南極磷蝦TM進行熱穩定性實驗、pH值穩定性實驗和體外模擬胃腸消化實驗；根據歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物信息研究所（European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI）分析比對不同甲殼動物TM的氨基酸序列同源性；同時結合5種常用的生物信息學分析工具對南極磷蝦TM模擬表位肽進行預測，并利用SWISS-MODEL服務器對其空間結構進行同源建模；最終通過PyMOL軟件將預測出的候選表位在其空間結構上進行一一映射。本研究旨在通過借助先進的生物信息學技術對南極磷蝦TM模擬表位肽進行精準預測識別，并對其空間結構同源建模，為深入了解南極磷蝦TM過敏原，進而對其開展后續的致敏性消減及相關低致敏性產品的開發提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦 大連遼漁遠洋食品有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、α-糜蛋白酶（1∶1 200 U，來源于牛胰腺） 北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶（1∶4 180 U，來源于豬胃黏膜） 美國Sigma公司；胰蛋白酶（1∶2 500 U，來源于豬胰腺） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他常規化學試劑和藥品均購自天津大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

EASY-nLC 1000 UPLC系統、Q Exactive Plus MS儀美國賽默飛世爾科技公司；CR22N高速冷凍離心機、F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司；PowerPac Basic垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像系統 以色列DNR公司；Infinite M200多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；J-1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦TM提取純化

參照Liang Yinlong等[17]方法并略有修改。所有提取純化步驟若無特殊說明均在4 ℃下進行。取南極磷蝦肉按1∶10（g/mL）加入預冷20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），于組織搗碎機中搗碎。組織搗碎液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取沉淀按1∶10（g/mL）重新加入磷酸緩沖液，重復操作3 次。將最后得到的沉淀物按1∶2（g/mL）溶于50%預冷丙酮中，用恒速電動攪拌器攪拌4 h，組織液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，沉淀重新按1∶2（g/mL）溶于丙酮溶液中，重復操作2 次。將離心得到的沉淀取出，于室溫下自然風干24 h制成丙酮粉。取丙酮粉按1∶10（g/mL）加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含1 mol/L KCl、10 mmol/Lβ-巰基乙醇），用恒速電動攪拌器攪拌抽提一夜，抽提液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，保留上清液。向上清液中加入1 mol/L HCl溶液調至pH 4.5，靜置2 h后于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，保留沉淀。將沉淀溶于適量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中，用1 mol/L NaOH溶液調至pH 7.6使沉淀完全復溶。向溶液中緩慢加入41%～60% (NH4)2SO4，邊加邊攪拌直至其完全溶解，靜置4 h后于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，保留沉淀。將沉淀重新復溶于適量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中，于100 ℃沸水浴10 min，待其冷卻至室溫后于10 000 r/min離心10 min，上清液于真空冷凍干燥機中凍干，置于－80 ℃保存備用。

1.3.2 蛋白質含量測定

參照BCA蛋白濃度測定試劑盒的使用說明書。依次向96 孔酶標板的蛋白標準品孔中加入20 μL質量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的BSA標準品溶液，再向96 孔酶標板的樣品孔中依次加入20 μL被稀釋至不同質量濃度的樣品溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 mg/mL），之后向各孔中加入200 μL BCA工作液。將酶標板于37 ℃避光靜置15～30 min，利用酶標儀測定標準品溶液和樣品在562 nm波長處的吸光度，繪制標準曲線，根據標準曲線計算提取純化的南極磷蝦TM樣品中蛋白質含量。

1.3.3 SDS-PAGE實驗

制備12%分離膠和4%濃縮膠。將提取純化過程中各取樣點及最終得到的南極磷蝦TM樣品均稀釋至1 mg/mL，取適量樣品與蛋白上樣緩沖液（5×）按4∶1（V/V）混合均勻，于100 ℃沸水浴5 min。Marker上樣5 μL，其余各樣品均上樣10 μL。濃縮膠中80 V電泳30 min，分離膠中100 V電泳180 min，結束后取出凝膠，用R-250染色2 h，加脫色液洗脫至各電泳條帶清晰為止。最后利用凝膠成像系統掃描拍照。

1.3.4 目的蛋白UPLC-MS/MS鑒定

1.3.4.1 膠內酶解

將目的蛋白條帶切取下來，用50%乙腈溶液（含50 mmol/L碳酸氫銨）脫色，加100%乙腈孵育5 min脫水。加入10 mmol/L二硫蘇糖醇溶液于37 ℃孵育60 min，加100%乙腈脫水。之后加55 mmol/L碘代乙酰胺溶液于溫室下避光孵育45 min后用50 mmol/L碳酸氫銨溶液清洗，再用100%乙腈脫水。最后加入含10 ng/μL胰蛋白酶的50 mmol/L碳酸氫銨溶液于冰上孵育1 h，棄去其余溶液，膠塊于37 ℃下酶解過夜。依次用乙腈-甲酸（10∶1，V/V）溶液和100%乙腈提取酶解后的肽段，冷凍旋干備用。

1.3.4.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC條件：ReproSil-Pur C18色譜柱（孔球形硅膠1.9 μm，孔徑120 ?樹脂填充）；流動相A：含0.1%甲酸和2%乙腈溶液；流動相B：含0.1%甲酸和90%乙腈溶液。梯度洗脫：0～22 min，94%～65% A、6%～35% B；22～26 min，65%～20% A、35%～80% B；26～30 min，20% A、80% B。流速550 nL/min。

MS條件：納噴電離源；離子源電壓2.1 kV；掃描范圍m/z350～1 800；分辨率70 000；MS/MS條件：分辨率17 500；自動增益控制5×104；信號閾值5×103ions/s；最大注入時間200 ms；動態排除時間20.0 s。

1.3.4.3 數據庫檢索

用Proteome Discoverer 2.4軟件對采集到的MS和MS/MS數據進行檢索，數據庫為Euphausia superba（UniProt，168 條肽段序列）。

1.3.5 南極磷蝦TM性質測定

1.3.5.1 熱穩定性測定

參照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。稱取適量提取純化的南極磷蝦TM凍干樣品溶于去離子水中，稀釋至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多個2 mL離心管中，分別將其置于20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴加熱30 min。待各離心管冷卻至室溫，于4 000 r/min離心5 min，取上清液進行后續分析。

1.3.5.2 pH值穩定性測定

參照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。稱取適量提取純化的南極磷蝦TM凍干樣品溶于去離子水中，稀釋至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多個2 mL離心管中，分別調節pH值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，孵育1.5 h，而后將pH值調回7.0。吸取經酸堿處理后的各樣品溶液進行后續分析。

1.3.5.3 體外模擬胃腸消化穩定性測定

參照Minekus等[19]的方法配制人工模擬胃液、腸液。參照Román-Carrasco等[20]的方法并適當修改進行體外模擬胃腸消化。模擬胃液消化反應體系共10 mL，胃蛋白酶活力與純化的南極磷蝦TM比例為182 U/mg，體系中TM終質量濃度為1 mg/mL。整個消化過程均在37 ℃水浴條件下勻速振蕩進行。分別在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分鐘依次取樣0.5 mL，同時立即加入0.1 mol/L NaOH終止液調節至pH 7.0終止消化。取模擬胃液消化終點溶液5 mL，加入配制好的人工模擬腸液至整個反應體系體積為10 mL，胰蛋白酶活力、糜蛋白酶活力與TM比例分別為34.5、0.44 U/mg，體系中TM終質量濃度為0.5 mg/mL。整個消化過程均在37 ℃水浴條件下勻速振蕩進行。分別在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分鐘依次取樣0.5 mL，隨即沸水浴5 min終止消化。所有樣品置于－20 ℃保存用于后續分析。

1.3.5.4 SDS-PAGE分析

對不同溫度、pH值、消化時間處理下的樣品穩定性進行SDS-PAGE分析，樣品質量濃度均稀釋至0.5 mg/mL，上樣量10 μL，方法同1.3.3節。

1.3.5.5 熒光光譜分析

參考Li Ke等[21]的方法，稍作修改。通過熒光分光光度計測定不同溫度、pH值、消化時間處理下樣品的內源性熒光光譜。用緩沖液將各樣品溶液稀釋至0.05 mg/mL。設置激發波長為280 nm，發射光譜范圍為250～500 nm，激發和發射狹縫寬度為10.0 nm，掃描速度為1 500 nm/min。

1.3.5.6 圓二色光譜分析

參考Lin Haixin等[22]的方法，稍作修改。應用圓二色光譜儀檢測不同溫度、pH值、消化時間處理下樣品的二級結構穩定性。用緩沖液將各樣品溶液稀釋至0.005 mg/mL。設置掃描速度100 nm/min，帶寬2 nm，響應時間1 s，在190～260 nm波長范圍內測定樣品的平均殘留橢圓率及相對含量。

1.3.6 南極磷蝦TM序列同源性分析

通過EMBL-EBI氨基酸序列數據庫對南極磷蝦TM與其他生物的TM序列同源性進行分析。將南極磷蝦TM完整的氨基酸序列作為查詢條件，利用EMBL-EBI數據庫中Clustal Omega對比工具及UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL數據庫進行同源序列檢索[23-24]，最終得到TM氨基酸序列同源性相關信息。

1.3.7 南極磷蝦TM模擬表位肽預測識別

1.3.7.1 南極磷蝦TM氨基酸序列獲取

通過美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）獲取南極磷蝦TM氨基酸序列信息。

1.3.7.2 生物信息學分析

利用生物信息學軟件DNAStar Protean[25]、ANTHEPROT[26]對南極磷蝦TM過敏原表位進行預測。通過對南極磷蝦TM一級結構的親水性、可塑性、抗原性、表面可及性和溶劑可及性等參數進行分析，預測識別出南極磷蝦TM的線性模擬表位肽序列。

利用生物信息學在線工具BepiPred 1.0 server[27]、ABCpred server[25]和Immunomedicine Group[28]分別對南極磷蝦TM過敏原表位進行預測：BepiPred 1.0 server通過結合隱馬爾可夫模型和親水性參數評分給出預測的線性表位序列[29]；ABCpred server基于人工神經網絡模型分析預測其線性表位[25]；Immunomedicine Group根據抗原傾向預測識別出南極磷蝦TM的模擬抗原決定簇。

對上述5種生物信息學工具分析預測出的南極磷蝦TM的線性模擬表位肽序列進行整合，綜合分析不同工具預測出的結果。

1.3.8 南極磷蝦TM空間結構預測及模擬表位肽映射

利用SWISS-MODEL服務器[30]構建南極磷蝦TM空間結構模型。登錄SWISS-MODEL在線服務器，上傳南極磷蝦TM氨基酸序列，選擇序列同源性最高的1c1g.2.A為模板自動建模，進而獲得南極磷蝦TM的空間結構模型。根據Structure Assessment模塊中的拉氏構象圖分析預測結果的穩定性。

利用PyMOL軟件[31]對預測出的南極磷蝦TM線性模擬表位肽在其空間結構中進行映射。將SWISS-MODEL服務器構建的南極磷蝦TM空間結構模型以pdb格式導出，在PyMOL軟件中打開該文件，以不同的標注顏色將各線性模擬表位肽一一映射到其空間結構對應的位置上。

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次，采用SPSS Statistics 19軟件對實驗結果進行差異顯著性分析，通過TBtools軟件繪制同源性分析結果，并用Origin 2019軟件處理并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦TM的提取純化分析

如圖1所示，南極磷蝦肉經磷酸緩沖液去除肌漿蛋白、丙酮溶液除脂、抽提液粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多步提取純化操作，不斷去除雜條帶。根據泳道6目的蛋白條帶與Marker條帶的比對發現，最終僅在32 kDa附近得到單一條帶。利用Image J軟件對其進行灰度掃描分析，得到提取純化的蛋白純度達93.24%。研究表明，TM分子質量約34～38 kDa[1]，等電點約4.5[32]，是一種對熱穩定的蛋白[33]。因此，經一系列提取純化后最終在32 kDa附近得到的蛋白條帶很可能是南極磷蝦TM。

該提取純化方法中最關鍵的幾個步驟分別是熱處理除雜、等電點沉淀和硫酸銨鹽析。首先，由于TM是一種熱穩定蛋白[33]，因此高溫加熱并不會使其發生降解，而其他不耐高溫的蛋白則在此過程中被破壞，所以與泳道3相比泳道4的蛋白條帶明顯減少，部分條帶也有減輕（圖1）。其次，不同蛋白質的等電點各不相同，TM在其等電點處的溶解度最小[34]，因而在pH 4.5附近大部分的TM聚集析出。最后，大多數研究表明，硫酸銨飽和度在40%～90%時可將TM沉淀析出[35]，故在此基礎上，本研究在41%～60%的硫酸銨飽和度下分離得到了大量鹽析蛋白沉淀。經過以上幾個重要的提取純化步驟，最終得到了較為純凈的南極磷蝦TM。該方法方便、快捷地得到了高純度的南極磷蝦TM，省去了液相、柱層析等繁瑣的提取純化步驟，同時也避免了蛋白的進一步損失，適合實驗室采用。

圖1 南極磷蝦TM提取純化SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of crude and purified TM from Antarctic krill

2.2 目的蛋白UPLC-MS/MS分析

如圖2所示，根據MS掃描結果初步確定目的蛋白的肽段數量及出峰位置，進而對所得肽段進行MS/MS掃描確定其氨基酸序列，共鑒定到89 條肽段，通過數據庫檢索發現該89 條肽段均屬于UniProt數據庫中收錄的A7VKE0蛋白（E. superba，TM），將鑒定到肽段的氨基酸數目與該蛋白總氨基酸數目相比得到其肽段覆蓋率達97%，從而確定提取純化得到的目的蛋白為南極磷蝦TM，登錄號為A7VKE0，蛋白分子質量為32.6 kDa。

圖2 南極磷蝦TM的MS譜圖Fig. 2 Primary mass spectrum of TM from Antarctic krill

2.3 南極磷蝦TM性質分析

2.3.1 南極磷蝦TM熱穩定性分析

由圖3a可知，溫度由20 ℃逐漸升至100 ℃的過程中，TM條帶保持穩定，均未發生降解，也無其他新的條帶生成。熒光光譜技術用于檢測蛋白內源熒光，通過分析光譜峰位、強度等變化進而推斷蛋白質三級結構的變化[36]。由圖3b可知，隨溫度的升高，南極磷蝦TM在295 nm波長處的熒光強度逐漸增強。溫度由20 ℃升至60 ℃的過程中，熒光強度變化幅度不大；值得注意的是當溫度升至70 ℃時，熒光強度有較大程度提升；加熱至80 ℃時，熒光強度明顯增強，且直至上升至100 ℃時，熒光強度逐漸達到峰值，此間變化不再明顯。這說明隨著溫度的升高，南極磷蝦TM高級結構逐漸伸展，溫度上升至70 ℃時，其內部疏水區域暴露可能增多，加熱至80 ℃時，TM多肽鏈進一步伸展，使得疏水基團暴露程度大幅提高，熒光強度明顯增強。圓二色光譜技術被廣泛應用于分析蛋白質的二級結構組成和變化[37]。由圖3c可知，南極磷蝦TM在190 nm波長附近有一正譜帶，在208 nm和222 nm波長附近有兩個負譜帶，且在溫度為20 ℃時其橢圓度絕對值最大；隨著加熱溫度的升高其橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋相對含量逐漸降低；然而，加熱溫度超過80 ℃的TM冷卻至室溫后其橢圓度絕對值又有一定幅度的增強。由圖3d可知，南極磷蝦TM主要由α-螺旋和少量無規卷曲結構組成；加熱溫度由20 ℃逐漸升至60 ℃時，α-螺旋相對含量逐漸降低，無規卷曲含量總體呈升高趨勢，但變化幅度較緩；當溫度升至70 ℃時，α-螺旋相對含量明顯下降至最低，此時β-折疊相對含量明顯增加；加熱至80 ℃時，其結構組成與70 ℃時變化不大，無規卷曲相對含量最多，說明此溫度下TM二級結構較為松散；值得注意的是加熱溫度自80 ℃后，α-螺旋相對含量略有回升，說明經高溫加熱冷卻后，TM的α-螺旋結構有一定恢復。

圖3 熱穩定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結構相對含量（d）Fig. 3 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing thermal stability of TM in Antarctic krill

2.3.2 南極磷蝦TM的pH值穩定性分析

由圖4a可知，pH值由1.0逐漸升至13.0的過程中，TM條帶始終穩定存在，在其下方均沒有生成其他小分子降解條帶。由圖4b可知，pH 5.0時，TM的熒光強度最強；pH值升至7.0時，熒光強度略有下降；隨著pH值向更酸/堿的方向變化，熒光強度逐漸降低，且堿性條件下熒光強度較酸性條件下更低。這些說明南極磷蝦TM在pH值接近其等電點（pH 4.5）時結構較穩定，經酸/堿處理后可能導致發色基團暴露的微環境發生變化，TM結構可能發生部分聚集或折疊，使部分氨基酸殘基被包埋，且pH值偏離等電點程度越大其結構變化越嚴重，因此導致熒光強度的改變。由圖4c可知，pH 5.0時，TM在208 nm和222 nm波長處的橢圓度絕對值最大；經酸/堿處理后，橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋逐漸減少，蛋白構象發生改變。由圖4d可知，pH 5.0時，南極磷蝦TM的α-螺旋相對含量最高，且結構僅由α-螺旋和少量無規卷曲組成；當pH值向酸/堿方向變化時，α-螺旋相對含量逐漸降低，β-折疊和無規卷曲逐漸增多；pH 13.0時，還出現了少量β-轉角結構。這些說明經酸/堿處理后，TM構象發生改變，進而可能引起分子間靜電作用力降低或削弱氫鍵結合；極端堿性條件下，TM變性程度較嚴重，但從整體上看南極磷蝦TM依然保持以α-螺旋為主的二級結構。

圖4 pH值穩定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結構相對含量（d）Fig. 4 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing pH stability of TM in Antarctic krill

2.3.3 南極磷蝦TM的體外模擬胃腸消化穩定性分析

圖5 模擬胃液消化穩定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結構相對含量（d）Fig. 5 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing simulated gastric digestion stability of TM in Antarctic krill

由圖5a可知，南極磷蝦TM在模擬胃液消化2 min開始出現降解，消化5 min時，出現較明顯的降解條帶；隨著消化反應的進行TM條帶逐漸變淺下移，隨之產生一系列小分子降解條帶，多集中于17～20 kDa之間；消化至120 min時，TM條帶仍未完全降解。由圖5b可知，隨著模擬胃液消化反應的進行，TM在295 nm波長處的熒光強度在消化0.5 min時出現上升而后逐漸降低，在355 nm處產生一新峰，且熒光發射波長出現紅移。說明在胃消化反應初期，TM構象可能發生伸展導致部分疏水區域暴露，隨著消化時間的延長，其結構又重新且不斷折疊變化，在此過程中可能有新的芳香族氨基酸側鏈暴露出來。由圖5c可知，TM在190 nm波長附近的峰的橢圓度逐漸降低，且在208 nm和222 nm波長處的峰的橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋不斷減少。由圖5d可知，隨著模擬胃液消化，TM的α-螺旋相對含量整體呈下降趨勢，β-折疊相對含量整體呈增加趨勢，無規卷曲含量總體變化不大。這說明TM經胃液消化后蛋白結構發生部分折疊，但二級結構總體組成變化不明顯。

由圖6a可知，南極磷蝦TM在隨即進行的模擬胃-腸消化反應中被進一步降解，生成一系列分子質量更小的降解條帶，主要集中在11～20 kDa之間；消化反應進行到60 min時，TM條帶開始變得模糊；消化至120 min時，TM幾乎被消化完全，條帶基本消失。由圖6b可知，在模擬胃-腸消化反應初期，TM在295 nm波長處的熒光強度迅速大幅降低，隨后在295 nm和355 nm波長附近的熒光強度也不斷下降，且在355 nm波長處出現輕微紅移。表明TM在胰/糜蛋白酶作用下發生高度水解產生一系列小分子肽段，其結構迅速發生改變，而后這些水解肽段可能在分子相互作用下又重新形成聚集體掩埋了部分熒光發色基團，從而導致熒光猝滅；同時，構象改變又可能使部分新的芳香族氨基酸殘基暴露引起紅移。TM模擬胃-腸消化的圓二色光譜圖顯示出明顯改變，如圖6c所示：自消化0.5 min起，在208 nm和222 nm波長處的雙負峰帶消失，轉為在200 nm波長附近的單負峰帶，且譜線總體有藍移的趨勢。這說明經模擬胃-腸消化后，南極磷蝦TM的α-螺旋結構完全消失、β型結構增加，且體系的親水性降低、疏水性增高。由圖6d可知，南極磷蝦TM剛進入模擬胃-腸消化體系時，α-螺旋結構就被完全破壞并消失，無規卷曲和β-轉角結構增多；β-折疊在整個消化過程中經歷了減少-增加-減少等的動態變化，最終完全消失。這說明經過模擬胃-腸消化，南極磷蝦TM的二級結構有序性降低，消化過程中結構發生動態變化，最終僅由大量無規卷曲和部分β-轉角結構組成。

圖6 模擬胃-腸消化穩定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結構相對含量（d）Fig. 6 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d) showing the simulated gastrointestinal digestion stability of TM in Antarctic krill

圖7 TM氨基酸序列同源性分析Fig. 7 Homology analysis of amino acid sequence of TM

綜上，南極磷蝦TM在一定加熱溫度范圍內具有較好的熱穩定性，但在超過80 ℃的極端高溫下，其疏水區域暴露，結構改變，α-螺旋結構易被破壞，然而冷卻至室溫后其天然構象又部分恢復重新形成；其次，南極磷蝦TM對于pH值的變化較能維持穩定，且對酸性條件具有較強耐受性，而極端酸/堿條件可能使其部分變性，結構發生聚集或折疊；此外，南極磷蝦TM對胃液消化具有較強的穩定性，能被胃蛋白酶初步降解產生一系列小分子肽段，其二級結構基本保持完整，而對進一步的腸液消化穩定性較差，最終被胰蛋白酶和糜蛋白酶完全降解，生成分子質量更小的肽段，結構變得松散無序。這些結果與何欣蓉等[18]對章魚TM理化性質研究結論相似。這很可能與南極磷蝦TM的結構及氨基酸組成有關；TM主要由α-螺旋結構組成[38]，α-螺旋結構具有一定的剛性，在蛋白質結構中發揮穩定性作用[39]，因此TM獨特的α-螺旋結構極有可能是使其對熱和酸堿保持極強耐受性的原因；此外，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶作用的氨基酸不同[40]，所以消化結果的差異很可能與南極磷蝦TM的氨基酸序列組成有關。

2.4 南極磷蝦TM氨基酸序列同源性分析

對于系統給出的45種不同生物TM氨基酸序列，親緣關系越近的生物TM序列一致性越高。如圖7所示，南極磷蝦TM與太平洋磷蝦TM的序列同源性高達98.2%，與斑節對蝦、凡納對蝦等其他蝦的TM序列同源性多數在88%以上，而與鋸緣青蟹、腐食酪螨、水蚤等序列同源性稍低，分布在82%～88%之間。很多研究發現甲殼類動物TM具有高度保守的氨基酸序列，同源性在88%～100%，這種高度的序列同源性很可能正是甲殼類物種之間臨床交叉反應發生頻率高的原因[23]。此外，甲殼類動物TM與蟑螂、塵螨也有很高的序列同源性，分別為80%～97%和78%～98%[23]。這也與本研究分析結果幾乎一致。

2.5 生物信息學預測南極磷蝦TM模擬表位肽

從NCBI數據庫中獲得南極磷蝦TM（GenBank：BAF76430.1）氨基酸序列，該蛋白共由284 個氨基酸組成。

二級結構、表面可及性、柔韌性、高親水性、易暴露區域等均是預測抗原表位的重要特征，它們為表位鑒定提供了強有力的證據[7]。DNAStar Protean和ANTHEPROT軟件主要以高親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數4 個特征作為預測依據給出候選過敏原表位。BepiPred 1.0 server、ABCpred server和Immunomedicine Group通過氨基酸的理化性質，如二級結構、親水性、可及性、柔韌性、暴露表面、抗原傾向等，分析預測出可能性高的過敏原表位。表1列出了各生物信息學工具預測出的過敏原表位區域。然而，每種軟件單獨使用時都會有一定的局限性[41]，因此，綜合分析5種生物信息學工具的預測結果，同一表位被識別的軟件越多，則其準確性可能越高，將不少于3種工具共同預測出的過敏原表位確定為南極磷蝦TM候選模擬表位肽，如表2所示。共篩選得到8 條南極磷蝦TM線性模擬表位肽序列，分別為EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。

表1 各生物信息學工具預測的南極磷蝦TM模擬表位肽Table 1 Mimotope peptides of TM in Antarctic krill predicted by immunoinformatics tools

表2 南極磷蝦TM模擬表位肽最終預測結果Table 2 Definitive prediction results of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

目前，一些甲殼類TM表位已被鑒定，如褐對蝦（Penaeus aztecus）[8]、凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）[42]、斑節對蝦（Penaeus monodon）[7]、中國對蝦（Penaeus chinensis）[16]等，具體表位信息如表3所示。對比發現，不同甲殼類TM間具有相似的表位序列，這很可能是它們彼此間具有高度過敏交叉反應性的原因之一。本研究預測得到的南極磷蝦TM模擬表位肽與這些已經驗證的甲殼類TM抗原表位相比顯示出了較高的重疊率，對于其中部分表位序列具有高覆蓋率，這說明本研究的預測結果可能具有較高的準確性；但對于模擬表位肽中某些氨基酸的組成及序列長度等方面與這些已被鑒定出的抗原表位仍具有一定差異。

此外，通過生物信息學工具預測出的表位僅僅是理論層面，還需要后續傳統生物學方法結合免疫學實驗等對其進行驗證才能得到更加準確的過敏原表位。盡管如此，生物信息學技術還是憑借其快速、高效、精準等諸多優點為后續的蛋白致敏性相關研究提供了切實科學依據。

表3 不同甲殼類TM表位和南極磷蝦TM模擬表位肽的比較Table 3 Comparison of mimotope of TM in different crustaceans and those in Antarctic krill

2.6 南極磷蝦TM空間結構建模及模擬表位肽映射分析

如圖8所示，通過SWISS-MODEL服務器對南極磷蝦TM進行同源建模，采用序列近似度達55.99%的1c1g.2.A為模板，最終預測得到由兩條肽鏈平行纏繞而成的α-螺旋構型的南極磷蝦TM空間結構（圖8a）。通過服務器自帶的Structure Assessment模塊對建模得到的TM空間結構穩定性進行評價，結果顯示高達98.05%骨架的φ角和ψ角分布于可靠區，僅有0.53%分布于異常區（圖8b）。因此，預測的南極磷蝦TM空間結構模型是穩定可靠且具有高質量。

圖8 南極磷蝦TM空間結構預測Fig. 8 Spatial structure prediction of TM in Antarctic krill

南極磷蝦TM模擬表位肽映射結果如圖9所示。利用PyMOL軟件將生物信息學工具最終預測出的南極磷蝦TM的8 條模擬表位肽在其空間結構對應位置一一進行映射，可以看出候選模擬表位肽均勻分布在整個蛋白質中，且多位于α-螺旋內。

圖9 南極磷蝦TM模擬表位肽映射Fig. 9 Mapping of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

3 結 論

通過對南極磷蝦進行除肌漿蛋白、丙酮除脂、抽提液粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多個步驟，最終提取純化出較為純凈的目的蛋白，SDSPAGE顯示其條帶位于32 kDa附近，灰度掃描分析其純度達93.24%。經UPLC-MS/MS鑒定該目的蛋白確為南極磷蝦TM，蛋白分子質量為32.6 kDa，肽段覆蓋率高達97%，UniProt蛋白數據庫登錄號為A7VKE0。通過對其進行進一步的性質研究得到南極磷蝦TM是一種對酸堿具有較強耐受力和對熱穩定的蛋白質，此外TM對胃液消化表現出較強穩定性，而對進一步的腸液消化穩定性較差，最終被降解為一系列小分子肽段。氨基酸序列同源性分析結果表明南極磷蝦TM具有高度保守性，與26種甲殼類生物同源性在88%以上，與太平洋磷蝦TM序列同源性更是高達98.2%。利用DNAStar Protean、ANTHEPROT、BepiPred 1.0 server、ABCPred server和Immunomedicine Group 5種生物信息學工具分別對南極磷蝦TM模擬表位肽進行分析預測，最終共篩選出8 條致敏性極高的候選過敏原模擬表位肽，分別是EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。同時利用SWISS-MODEL服務器對南極磷蝦TM進行同源建模，預測得到其空間結構為α-雙螺旋結構。通過PyMOL軟件對預測到的8 條TM模擬表位肽進行一一映射，結果顯示它們均勻分布在整個蛋白質結構中。本研究提取純化得到了較為純凈的南極磷蝦TM；同時利用多種生物信息學工具對其模擬表位肽的預測，不僅進一步增加了研究者對南極磷蝦TM過敏原的認識，也極大程度上提高了結果的準確性；通過對其空間結構的預測及模擬表位肽的映射為過敏原表位的定位縮小了范圍，使得定位更加精準。本研究為未來基于南極磷蝦TM表位的相關研究提供了科學參考，不過對其準確的過敏原表位及其致敏性評價還需進一步實驗驗證。