黏質沙雷氏菌磷脂酶A1輔助蛋白PlaS對宿主菌細胞膜的影響及亞細胞定位

周 杰，吳政浩，李 闖，劉慶濤，張會敏，王 洲，劉 艷，薛正蓮

（安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽省工業微生物分子育種工程實驗室，微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

磷脂酶A1（EC3.1.1.3，PlaA1）是一類酰基水解酶，可催化sn-1位磷脂水解成游離脂肪酸和溶血磷脂，廣泛應用在糧油精制、化妝品加工等行業[1-2]。PlaA1在諸多動植物、微生物中皆有發現，如牛大腦與睪丸、大鼠肝臟、黃蜂毒液、擬南芥、沙雷氏菌、鏈霉菌等[3-7]。相較于其他磷脂酶，PlaA1的生理功能在很大程度上仍待探索。已經探明PlaA1的生理功能有：參與膜蛋白合成與修復、產生溶血磷脂酸及胞內信號傳導、增強細菌侵襲和黏附性等[8-12]。

目前關于PlaA1的研究方向有：異源表達、分子改造及發酵條件優化等[12-13]。有學者在大腸桿菌中表達來自沙雷氏菌磷脂酶A1基因（plaA1）時發現，plaA1基因下游還有一段開放閱讀框，與plaA1有8 bp重疊，與調控磷脂酶A1表達有關，被命名為磷脂酶A1輔助蛋白基因plaS[14-15]。課題組前期研究已經驗證，PlaS蛋白沒有磷脂酶活性，但有調控磷脂酶A1作用。在大腸桿菌中，無論是PlaA1與PlaS共表達，還是PlaS單獨表達都表現出抑制宿主生長，而單獨表達PlaA1時會產生大量無酶活性的包涵體且不表現抑制，這表明PlaS可調控磷脂酶A1胞外表達[16]。通過對黏質沙雷氏菌磷脂酶A1輔助蛋白S（GenBank，Protein-ID：AFN44705.1）的進一步研究發現，PlaS屬于Ankyrin錨定蛋白家族中的ANK蛋白[17]。一般Ankyrin由若干個（2 個以上）蛋白重復序列（ANK repeat）串聯堆疊，以形成不同的彎曲程度，從而決定成熟錨蛋白的眾多生理功能[18-20]。錨蛋白的功能繁多，如調控細胞信號轉導、調節轉錄和細胞周期及參與各種轉運現象等[18,21-23]，它們通常在介導特定的蛋白質相互作用中發揮作用[24]。因此，研究PlaS有助于Ankyrin的改造與應用。

已有學者關注到PlaA1對宿主細胞的毒害作用[25-26]，但目前國內外對磷脂酶A1輔助蛋白抑制宿主生長現象的報道屈指可數。在大腸桿菌異源表達PlaS過程中，僅可通過Western blot檢測其極低產量，但又表現出明顯抑制作用，因而研究PlaS在表達過程中對宿主的影響有重要價值。朱昊等[27]和甘玉飛[28]先后利用N端截短技術分別截除PlaS的N端前35 個和前27 個氨基酸，發現截短后對宿主細胞生長抑制作用消失，初步探索PlaS抑制作用的關鍵區域為前27 個氨基酸。因此，PlaS是一種具有錨蛋白重復結構的疏水性輔助蛋白，可以增強磷脂酶A1表達與活性，同時也抑制宿主大腸桿菌生長。研究人員通過抗菌實驗發現，疏水性抗菌肽與細菌細胞膜有強親和作用[29]。細菌細胞膜的磷脂雙分子層與蛋白質構成的富有彈性的半透性薄膜，參與細胞信息傳遞、物質傳輸、能量傳導等過程，是細胞進行正常生理活動的重要參照。細胞膜具有動態的通透性和流動性等，而抗菌物質常通過改變細胞膜性能以破壞其完整性[30-31]。磷脂作為細胞膜的主要成分，其含量的變化也會影響細胞膜的狀態[32]。蛋白質與細胞膜間的親和作用常用亞細胞定位結果指示。通過生物信息學亞細胞定位預測顯示Ankyrin錨蛋白傾向于定位在革蘭氏陰性菌細胞膜上，PlaS可能與原核細胞中細胞膜上的脂質或蛋白質分子相互作用。課題組前期通過生物信息學預測與融合熒光報告基因示蹤法確定BsnMenA蛋白是一種在大腸桿菌中定位于細胞膜上的膜蛋白[33]，這為研究PlaS是否為膜蛋白提供基礎。然而，目前沒有明確的實驗證據表明PlaS是膜蛋白，對宿主膜性能有明確破壞作用。由于PlaS表達量極低，所以在探究異源表達PlaS對宿主細胞膜的影響時，需要在相同培養條件下取同等生長狀態、相同體積的菌懸液以作觀察。

本研究旨在通過檢測生長曲線觀察和顯示重組大腸桿菌生長抑制現象，采取一系列實驗考察PlaS表達后宿主大腸桿菌細胞膜性能、脂肪酸種類及組分的變化，并通過激光共聚焦顯微實驗驗證PlaS的亞細胞定位，為闡明PlaS抑制宿主生長的機制提供必要的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌BL21（DE3）、質粒載體pET28a（+）以及含有增強型綠色熒光基因egfp的pUC19質粒均為實驗室保存。P28菌是將pET28a（+）空載導入大腸桿菌BL21（DE3）中；SP28菌是插入plaS到質粒載體上構建的工程菌；dSP28是將plaS基因截除N端前27 個氨基酸序列后的截短基因pladS插入到pET28a（+）上構建的菌株；SeP28與eSP28以及MeP28和eMP28菌株是分別將egfp與plaS基因、egfp與膜蛋白BsnMenA基因menA分別按照先后順序載于pET28a（+）上，表達于大腸桿菌BL21（DE3）的菌株；eP28是egfp基因在大腸桿菌中表達的熒光對照菌；以上菌株由實驗室保藏，菌株構成如表1所示。

表1 各菌株構成說明Table 1 Description of structure of all strains used in this study

1.1.2 培養基與試劑

LB肉湯、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

卡那霉素（Kan）溶液：取5.00g Kan以無菌水定容至100 mL；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）溶液：取1.19 g IPTG以無菌水定容至50 mL，再通過0.22 μm濾膜過濾，使用注射器分裝（1 mL/份），－20 ℃保存備用；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）溶液：將DPH溶于四氫呋喃中，配制2 mmol/L DPH母液；N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，NPN）溶液：稱取0.054 8 g NPN溶于250 mL PBS中，得1 mmol/L NPN溶液，臨時貯存于棕色瓶中；鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）溶液：取0.05 g ONPG以超純水定容至50 mL，濃度為1.5 mmol/L。以上試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T100-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；960MC-PC熒光分光光度計 上海三科儀器有限公司；2010型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 日本島津公司；FV-1200激光共聚焦微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線的確定

從LB平板中挑出單個菌株，轉移至LB肉湯中培養至對數生長期。調節OD600nm為0.2時再以2%接種量轉移至含有Kan的新LB肉湯中培養。OD600nm約為0.6時加入適量IPTG誘導劑。在整個過程中，每隔2 h取樣測定OD600nm，以P28菌株為對照，培養條件為37 ℃、200 r/min。

1.3.2 細胞外膜通透性測定

用0.85% NaCl溶液沖洗具有不同誘導時間（0、4、8、12 h）的菌體沉淀，并重新懸浮使OD600nm為0.4左右。在黑暗中取1 mL細菌懸液和20 μL 1 mmol/L NPN溶液在石英比色管中快速振蕩混合，立刻測定熒光強度的變化，直到強度不再變化為止。激發和發射波長分別為350 nm和429 nm。以0.85% NaCl溶液為對照。

1.3.3 細胞內膜通透性測定

以ONPG為底物，通過測定從大腸桿菌釋放的胞質β-半乳糖苷酶活性確定細胞內膜通透性。將1.5 mmol/L ONPG溶液加入到稀釋為OD600nm=0.4的細菌懸液中，將混合物在37 ℃下靜置培養30 min，測定OD405nm，以ONPG溶液為對照。

1.3.4 細胞膜流動性測定

收集不同誘導時間（0、4、8、12 h）各個菌株，用PBS沖洗，重懸使OD600nm為0.3～0.4之間。加入適量2×10－3mmol/L DPH溶液，在暗室靜置30 min后測定熒光強度。激發波長為362 nm，發射波長為454 nm。

1.3.5 細胞表面疏水性測定

采用二甲苯吸附法測定，疏水性強的細菌傾向于附著在二甲苯有機相表面，逐漸上移并懸浮在有機相中[34]。用pH 7.0 PBS洗滌不同誘導時間的細菌數次并重懸，使OD600nm為0.6，記為A0。通過在試管中劇烈搖動，將2 mL懸浮液與800 μL二甲苯混合。室溫下靜置，直到細菌懸浮液完全分層，仔細吸取下層相，測定OD600nm，記為A1。以二甲苯吸附后殘留細菌占比表示細胞表面疏水性，按下式計算：

1.3.6 細胞膜中脂肪酸組成變化的測定

1.3.6.1 樣品前處理

取不同誘導時間的各菌懸液6 mL，4 000 r/min離心1 min，棄去上清液。加入1 mL皂化反應液（9.0 g NaOH、30.0 mL甲醇、30.0 mL去離子水），混勻，100 ℃加熱30 min，結束后立即冰上冷卻。然后，加入2 mL甲基化反應溶液（65.0 mL 37%濃鹽酸、55.0 mL甲醇），加熱至80 ℃維持10 min。熱處理后立即冰浴冷卻10 min，加入1.25 mL反應混合物（含正己烷和甲基叔丁基醚，V/V，1∶1），劇烈搖晃后靜置，直至溶液出現明顯分層。取上層油狀有機相。再加入3 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，混合后靜置等待分層。再將上層溶液的2/3轉移至標準瓶中，保存在－80 ℃下備用。

1.3.6.2 GC條件

TG-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度55 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升溫至205 ℃；以5 ℃/min升溫至250 ℃；以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持9 min。載氣流速2.0 mL/min；進樣口溫度220 ℃；進樣量1 μL；分流比5∶1；溶劑潤洗次數（前）：3；溶劑潤洗次數（后）：5；樣品潤洗次數：3。

1.3.6.3 MS條件

電子能量70 eV；電子電離源；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；界面溫度：280 ℃；質量掃描范圍m/z29～450。

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡熒光觀察

將重組菌SeP28和eSP28、空載陽性對照eP28、陰性對照P28和膜蛋白陽性對照MeP28和eMP28分別接種于50 mL新鮮LB肉湯中（Kan+），37 ℃、180 r/min過夜活化，轉移至50 mL新鮮肉湯中。監測OD600nm約為0.5時，加入0.1 mmol/L IPTG，在26 ℃、100 r/min下培養。為防止熒光蛋白在原核細菌中表達過量，導致熒光充盈整個視野，失去亞細胞定位能力，本研究從誘導表達開始每隔5 min取樣一次，每次取菌液1 mL，在高速低溫離心機中4 800 r/min離心3 min，沖洗并稀釋至適當倍數，滴加到激光共聚焦小皿中央凹板上，用激光共聚焦顯微鏡于488 nm波長下收集熒光信息，觀察重組菌中的熒光位置。

2 結果與分析

2.1 菌株生長曲線分析

為顯示表達PlaS蛋白的菌株生長抑制現象，比較各菌株的生長曲線。如圖1所示，誘導前各菌株生長狀態趨于一致。培養3.5 h時加入IPTG，誘導表達后，各菌株生長狀態開始分化。其中，P28、大腸桿菌BL21（DE3）與eP28菌株生長狀態一致，培養8 h前結束對數生長期且菌體濃度無明顯差異。而SP28菌株生長緩慢，培養7.5 h時OD600nm僅為1.104，10 h后已進入衰亡狀態；熒光重組菌eSP28與SeP28菌株生長曲線與SP28差異不明顯。相反，dSP28菌株保持指數生長，培養12 h后逐漸進入平穩期。結果表明，PlaS確實會導致宿主生長緩慢，宿主菌生長在誘導PlaS蛋白表達后受到抑制，而其N端前27 個氨基酸序列是PlaS抑制宿主生長的關鍵因素。

另外，dSP28菌株不僅解除了抑制，而且顯示出更穩定的指數增長，對數生長期可至少延長2 h，這可能與dSP28蛋白的理化性質有關。早期研究表明，PlaS屬于ANK repeat，其功能包括細胞信號轉導、維持細胞骨架的完整性以及調節細胞周期、炎癥反應、發育和各種運輸效應[18]。截短前27 個氨基酸的dSP28蛋白可能高度表達錨蛋白的一些功能，例如維持細胞完整性、促進細胞發育和調節細胞周期，這可能是dSP28保持高速增長并且持續更長時間的原因。

2.2 菌株細胞外膜通透性分析

NPN是一種疏水性熒光染料，在細菌內外膜間異常疏水的環境中，容易被特定波長激發產生強烈的熒光，可以指示外膜的損傷[35]。如圖2A所示，細菌的細胞外膜通透性整體隨誘導時間的增加呈增加趨勢。其中，dSP28和P28的細胞外膜變化趨勢基本一致，為逐漸增加；而SP28的細胞外膜通透性在誘導8 h達到最高，比對照P28提高了49.46%，但誘導12 h時，其熒光強度明顯下降，且顯著低于dSP28和P28。對比生長曲線可以看出，這一現象與菌株的衰退階段有關。當細菌處于衰退階段時，細胞外膜逐漸分解并消失，從而失去內外膜之間的疏水環境，導致NPN無法激發顯著的熒光[32,35]。因此，plaS基因的表達可以增加細胞外膜通透性，甚至表現為細胞外膜分解消失，誘發宿主死亡。

圖2 各菌株細胞膜特性變化Fig. 2 Changes in cell membrane properties of all strains

2.3 菌株細胞內膜通透性分析

細菌經誘導后會在質膜上產生β-半乳糖苷酶，可將乳糖類似物分解為半乳糖和黃色鄰硝基酚，因此β-半乳糖苷酶的活性可通過黃色確定[36]。如圖2B所示，隨著誘導時間的延長，3 個菌株的細胞內膜通透性均增加；dSP28和P28差異不顯著；SP28的細胞內膜通透性隨著誘導時間延長顯著增加（P＜0.05），在誘導12 h時比P28內膜通透性高41.14%，這可能是因為PlaS的表達對細胞內膜的影響導致細胞膜失去選擇透過性，SP28細胞失去穩態而死亡。

2.4 菌株細胞膜流動性分析

DPH是一種疏水性熒光物質，易于檢測和研究膜的流動性；能穿透磷脂雙分子層，與非極性尾區結合，發出強熒光，而不破壞膜結構。細胞膜流動性的嚴重下降是細菌細胞功能喪失的原因之一[37]。從圖2C可以看出，P28和dSP28的熒光強度隨誘導時間的延長先降低后升高，表明細胞膜流動性先升高后降低。SP28的細胞膜流動性在誘導8 h降低，誘導12 h顯著降低（P＜0.05）。細胞膜流動性的缺失是其結構異常的表現，結構破損甚至毀壞會使宿主菌細胞功能紊亂、缺乏穩態，進而導致細胞死亡。

2.5 菌株細胞表面疏水性分析

細胞表面疏水性是決定細菌對各種生物和非生物表面和界面非特異性黏附的因素之一，一般來說，細菌表面疏水性在與抗菌物質作用后會發生變化[38]。在陽離子抗菌肽的作用下，疏水性會降低，這也是細菌死亡的原因之一[31]。如圖2D所示，dSP28和P28的性能相對較為穩定；而SP28的表明疏水性在誘導4 h后顯著降低（P＜0.05），誘導12 h時比P28降低了45.33%，表明此時細胞膜已被破壞。需要注意的是，SP28在誘導4 h時表現出較高的表面疏水性，這可能與PlaS蛋白的疏水性有關，但同時也損傷了細菌，所以導致誘導4 h后疏水性下降。

2.6 PlaS對細胞膜脂肪酸的影響

細胞膜主要由脂質和蛋白質組成，膜脂成分的變化會影響其流動性。GC-MS鑒定了細胞膜脂肪酸種類與含量的變化。如圖3、4所示，鑒定出7種含量顯著的脂肪酸，可分為直鏈飽和脂肪酸、支鏈飽和脂肪酸、順式單不飽和脂肪酸、反式單不飽和脂肪酸和環丙烷脂肪酸。其中，直鏈飽和脂肪酸和反式單不飽和脂肪酸的含量與細胞膜剛性呈正相關，而支鏈飽和脂肪酸與順式單不飽和脂肪酸則會提高細胞膜流動性[32,39]。有證據表明，環丙烷脂肪酸與維持細胞膜穩定性有關[40]。

圖3 各菌株細胞膜主要脂肪酸含量的變化Fig. 3 Changes in the contents of major fatty acids in the cell membrane of all strains

圖4 各菌株細胞膜脂肪酸鑒定分類與含量變化Fig. 4 Changes in contents of cell membrane fatty acids in all strains

從圖3、4可以看出，對照組P28中所有種類的脂肪酸在誘導期間較為穩定。表現生長抑制的SP28中順式單不飽和脂肪酸的相對含量誘導8 h時為20.19%，比誘導4 h后降低了8.38%；而誘導時間相同時，對照P28中順式單不飽和脂肪酸的相對含量為30.34%，比SP28高10.15%。誘導8 h時，SP28直鏈飽和脂肪酸和反式單不飽和脂肪酸的相對含量分別為49.26%和15.13%，比4 h時分別增加9.62%和3.83%，相同誘導時間下比P28分別增加11.55%和5.31%。這些變化主要是由于SP28中10-十九碳烯酸含量的減少以及肉豆蔻酸、棕櫚酸、十八烷酸和反式-9-十八碳烯酸含量的增加。

上述結果表明，PlaS在表達后會引起細胞膜脂肪酸種類及含量變化，導致細胞膜剛性增加，主要因為直鏈飽和脂肪酸和反式單不飽和脂肪酸的相對含量提高以及順式單不飽和脂肪酸的相對含量降低、流動性降低、形態發生變化、細胞易死亡。值得注意的是，由圖3可知，在誘導期間，dSP28細胞膜脂肪酸中棕櫚酸的相對含量從30.98%下降到25.43%，而10-十九碳烯酸的相對含量從25.15%上升到33.44%。這表明dSP28沒有顯示出生長抑制，這也與生長曲線顯示的結果一致。

2.7 菌株細胞熒光成像分析

對SeP28、eSP28、eP28、MeP28、eMP28以及P28進行熒光成像分析。前期研究顯示，SeP28和eSP28可以順利表達，但表達量極低，僅由Western blot實驗測得有微量產物。由圖5可知，誘導表達時間為15 min的同組樣品中，膜蛋白表達菌株MeP28、eMP28在細胞膜上顯示出明顯的綠色熒光成像；熒光實驗菌株SeP28和eSP28與膜蛋白陽性對照菌株熒光成像一致，都在細胞膜上出現綠色熒光；而陽性空載對照eP28中熒光分布于整個細胞，陰性對照P28的整個視野未有可見熒光，證明PlaS定位于大腸桿菌細胞膜上。同時熒光成像顯示出SeP28和eSP28細胞表面瘦癟甚至破裂，不及MeP28和eMP28完整、飽滿，因而也具有抑制作用，結果與生長曲線相對應。對誘導表達20 min及以后的各個菌株樣品觀察發現，隨著PlaS和egfp表達量升高，不僅熒光強度增加，而且整個大腸桿菌中都會充盈綠色熒光，不易捕捉目的視野與畫面，故取誘導表達15 min為PlaS亞細胞定位最佳取樣時間。本實驗證明PlaS在大腸桿菌中定位于細胞膜上，屬于膜蛋白，且可以正確折疊并表達。

圖5 PlaS在大腸桿菌中的亞細胞定位（×600，聚焦倍數6.4）Fig. 5 Subcellular localization of PlaS in Escherichia coli(magnification × 600 and zoom × 6.4)

3 結 論

研究了黏質沙雷氏菌磷脂酶A1輔助蛋白PlaS對宿主大腸桿菌BL21（DE3）細胞膜性能和組成的影響與變化，并對PlaS的亞細胞水平定位進行了驗證。結果表明，磷脂酶A1輔助蛋白PlaS在宿主大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達8 h后，能夠導致宿主細胞膜的內外膜通透性明顯提高，流動性與表面疏水性明顯下降，表明細胞膜已遭破壞，宿主細胞發生損傷。PlaS在宿主中的表達，也引起了細胞膜脂肪酸種類與含量發生變化，直鏈飽和脂肪酸和反式單不飽和脂肪酸的增多以及順式單不飽和脂肪酸的減少導致細胞膜脂肪酸不飽和度上升，剛性增加、流動性降低，這與細胞膜流動性實驗結果一致。另外，激光共聚焦實驗也驗證了PlaS的亞細胞定位于細胞膜上，屬于膜蛋白。總之，這些結果將成為PlaS抑制宿主菌生長的靶點是細胞膜的直接證據，將有助于發掘PlaS對細菌生長產生抑制作用的深層次機理，PlaS蛋白的N端前27 個氨基酸序列，可能成為將來研究抑制機理的重點。此外，實驗數據可能為磷脂酶A1產生菌提高酶活性和產量與PlaS的功能開發方面帶來新的啟示。