化學(xué)交聯(lián)改性對(duì)高鏈玉米淀粉體外大腸發(fā)酵特性的調(diào)控機(jī)制

劉峻愷，王紹康，顧志鵬，扶 雄，黃 強(qiáng)，張 斌,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東 廣州 510700）

腸道菌群是一系列古細(xì)菌、真菌、真核生物等組成的復(fù)雜微生物群落總稱。作為一個(gè)被遺忘的人體“器官”[1]，它可以通過定植抗性、養(yǎng)分分解、刺激宿主細(xì)胞等免疫功能發(fā)揮作用。腸道微生物受多種因素的影響，包括基因、環(huán)境、母體菌群組成、年齡、飲食等[2-3]。其中，飲食干預(yù)是日常主要調(diào)節(jié)手段。

淀粉作為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹饕芰縼碓矗鋵?duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用值得關(guān)注?？剐缘矸弁ǔＶ覆槐晃负托∧c消化，可抵達(dá)大腸被結(jié)腸細(xì)菌發(fā)酵的淀粉總和。抗性淀粉根據(jù)其來源可以大致分為物理包埋淀粉、抗性淀粉顆粒、老化淀粉、化學(xué)改性淀粉、淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物五大類[4]。據(jù)報(bào)道，淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)和無定型區(qū)可在大腸發(fā)酵中同時(shí)均勻地被降解，發(fā)酵模式是從淀粉顆粒表面腐蝕，而后逐步滲透到顆粒內(nèi)部[5]。Wang Shaokang等[6]通過研究單一化學(xué)交聯(lián)淀粉體外糞菌發(fā)酵，指出丁酸的生成量與化學(xué)交聯(lián)淀粉的交聯(lián)度呈反比，且中低交聯(lián)度淀粉能夠促進(jìn)包含Blautia和Clostridiales在內(nèi)的不同有益菌生長。

雖然已有研究探明交聯(lián)淀粉在調(diào)控菌群方面有差異性[7-8]，但交聯(lián)基團(tuán)種類和交聯(lián)度對(duì)菌群改性的影響仍需進(jìn)一步探究。因此，本研究以高鏈玉米淀粉（highamylose maize starch，HAMS）為原料，分別使用包括三偏磷酸鈉（sodium trimetaphosphate，STMP）、三氯氧化磷（phosphoryl chloride，POCl3）和環(huán)氧氯丙烷（epichlorohydrin，EOH）在內(nèi)的3種不同類型化學(xué)交聯(lián)劑制備交聯(lián)淀粉，旨在探討不同類型化學(xué)交聯(lián)淀粉的體外大腸酵解特性及其對(duì)腸道菌群影響的異同，進(jìn)一步為功能性膳食纖維的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HAMS（Hylon V，直鏈淀粉45%） 上海宜瑞安公司；STMP、POCl3、EOH 上海麥克林公司；葡萄糖氧化酶過氧化物酶試劑盒 愛爾蘭 Megazyme公司；豬胰α-淀粉酶（8×USP/mg） 美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司；MR-Hei-Tec型加熱型磁力攪拌器 德國Heidoiph公司；EVO18掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司；HYQX-II型厭氧箱上海躍進(jìn)公司。

1.3 方法

1.3.1 交聯(lián)淀粉的制備

1.3.1.1 STMP交聯(lián)淀粉的制備

參考Woo等[9]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取20 g HAMS（干基）于燒杯中，加入蒸餾水調(diào)配成35 g/100 mL的淀粉乳，并加入2 g Na2SO4（抑制淀粉膨脹）后攪拌均勻。添加3%、6%、12%（以淀粉干基質(zhì)量計(jì)）STMP后，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11.0，45 ℃恒溫?cái)嚢? h。反應(yīng)結(jié)束后用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，終止反應(yīng)。用蒸餾水洗滌4 次，無水乙醇清洗3 次后離心，40 ℃恒溫烘干，過100 目篩備用。組內(nèi)樣品根據(jù)交聯(lián)劑添加量分別命名為S1、S2、S3，分別代表低、中、高STMP交聯(lián)改性的淀粉樣品。

1.3.1.2 POCl3交聯(lián)淀粉的制備

參考Felton等[10]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取20 g HAMS（干基）于燒杯中，加入蒸餾水調(diào)配成35 g/100 mL的淀粉乳，加入3 g Na2SO4后攪拌。加入0.5%、1%、2%（以淀粉干基質(zhì)量計(jì)）POCl3，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11.5，25 ℃恒溫?cái)嚢? h。反應(yīng)結(jié)束后用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 5.5，后續(xù)過程同于1.3.1.1節(jié)。組內(nèi)樣品根據(jù)交聯(lián)劑添加量分別命名為P1、P2、P3，分別代表低、中、高POCl3交聯(lián)改性的淀粉樣品。

1.3.1.3 EOH交聯(lián)淀粉的制備

參考Thomas等[11]報(bào)道的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取20 g HAMS（干基）于燒杯中，加入蒸餾水或去離子水調(diào)配成35 g/100 mL的淀粉乳，并加入2 g Na2SO4。添加1%、2%、4%（以淀粉干基質(zhì)量計(jì)）EOH后，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11.5，25 ℃恒溫?cái)嚢?4 h。反應(yīng)結(jié)束后用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 5.5，后續(xù)過程同于1.3.1.1節(jié)。組內(nèi)樣品根據(jù)交聯(lián)劑添加量分別命名為E1、E2、E3，分別代表低、中、高EOH交聯(lián)改性的淀粉樣品。

1.3.2 交聯(lián)度的測(cè)定

交聯(lián)度高低分別以磷含量（STMP交聯(lián)淀粉、POCl3交聯(lián)淀粉）[6]和沉降積（EOH交聯(lián)淀粉）[12]表示。

1.3.2.1 結(jié)合磷含量

準(zhǔn)確稱取0.4 g樣品于100 mL消化瓶中，加入1∶1（V/V）的硝酸-硫酸混合液15 mL，放置于加熱器上消化至溶液微沸、瓶口出現(xiàn)棕色氣體并最終變?yōu)榘咨?、溶液澄清透明為止。消化結(jié)束后，待液體冷卻，加入45 mL水，使用10 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0，并定容至100 mL。

取上述容量瓶?jī)?nèi)反應(yīng)液25 mL，放置于錐形瓶?jī)?nèi)，依次加入4 mL鉬酸銨溶液，2 mL抗壞血酸溶液，加完立即混勻，測(cè)定吸光度后根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線確定磷含量[13]。

1.3.2.2 沉降積

分別稱取0.5 g不同交聯(lián)淀粉樣品，加入25 mL蒸餾水調(diào)配成2 g/100 mL的淀粉乳，將燒杯放于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃加熱30 min，取出冷卻至室溫，向兩只10 mL離心管中倒入均勻攪拌后的冷卻淀粉乳，4 300 r/min離心2 min，讀取上清液體積。按式（1）計(jì)算沉降積[12]：

式中：V為上清液體積/mL；10為所取淀粉乳體積/mL。

1.3.3 抗性淀粉含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取600 mg淀粉樣品于50 mL離心管中，添加20 mL pH 5.2的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液和5 粒玻璃珠。渦旋混勻后加入5 mL含有豬胰酶和淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶的混酶，置于37 ℃恒溫水浴中進(jìn)行孵育。反應(yīng)120 min后取0.25 mL水解液，加入10 mL無水乙醇停止反應(yīng)。使用葡萄糖氧化酶過氧化物酶檢測(cè)試劑盒定量測(cè)定120 min淀粉釋放的葡萄糖含量[14]?？剐缘矸酆康挠?jì)算如式（2）所示：

式中：G120為淀粉酶水解 120 min 后產(chǎn)生的葡萄糖含量/mg；TG為樣品的總葡萄糖含量/mg。

1.3.4 X射線衍射分析

將待測(cè)淀粉粉末樣品放入X射線衍射儀樣品臺(tái)中進(jìn)行測(cè)試，采用波長為0.154 2 nm的CuKα射線進(jìn)行連續(xù)掃描。測(cè)試管壓為40 kV，管流為40 mA，衍射角（2θ）掃描區(qū)域?yàn)?°～30°，掃描步長為0.02°，掃描速率為0.0131°/s。相對(duì)結(jié)晶度被量化為晶體面積與總面積的比值，通過Peakfit軟件（版本7.0）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 體外大腸酵解模型

體外酵解實(shí)驗(yàn)參照Kaur等[15]的方法進(jìn)行修改。配制碳酸磷酸鹽緩沖液，121 ℃高壓滅菌20 min后加入0.25 g/L半胱氨酸鹽酸鹽，趁熱通入二氧化碳去除微量氧。將緩沖液放入?yún)捬跸鋬?nèi)過夜。準(zhǔn)確稱取50 mg淀粉樣品（干基）于帶有橡膠塞的厭氧瓶中，同時(shí)稱量50 mg低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）為陽性對(duì)照，空瓶為空白對(duì)照組。

將3 份等量的新鮮糞便樣品與預(yù)先滅完菌的碳酸磷酸鹽緩沖液按1∶6（mg/mL）比例混合，并用4 層濾布過濾后得到菌液。分別向厭氧瓶中加入1 mL菌液和4 mL碳酸磷酸鹽緩沖液，使用滅菌后的橡膠塞蓋緊，并用鋁箔蓋進(jìn)一步固定。37 ℃酵解8、12 h和24 h測(cè)定酵解后產(chǎn)氣量[15-16]。將混合物離心后的淀粉酵解殘?jiān)鼧悠肪鶆蚍盅b于3 個(gè)2 mL離心管中，于－80 ℃低溫冷凍保存，用作16S rRNA基因測(cè)序。上清液留存于離心管中用于后續(xù)短鏈脂肪酸檢測(cè)。

1.3.6 短鏈脂肪酸含量測(cè)定

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的淀粉酵解殘?jiān)鼧悠方鈨龊螅?3 000 r/min離心5 min。將上清液平均轉(zhuǎn)移至3 個(gè)2 mL離心管中。配制內(nèi)標(biāo)混合物（四甲基戊酸、偏磷酸、五水硫酸銅），然后將200 μL的內(nèi)標(biāo)混合物加入800 μL離心后上清液中。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)配備極性的Zebron ZB-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）以及前火焰離子化檢測(cè)器。升溫程序：初始柱溫為80 ℃，以8 ℃/min速率上升到190 ℃，并在192 ℃保持3 min。檢測(cè)器的溫度設(shè)置在230 ℃。用氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1 mL/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄峰面積，根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品中內(nèi)標(biāo)（四甲基戊酸）與目標(biāo)脂肪酸的峰面積之比求得矯正因子，并根據(jù)樣品中各短鏈脂肪酸的相對(duì)峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3.7 16S rRNA基因測(cè)序分析

序列數(shù)據(jù)分析主要通過微生物生態(tài)學(xué)定量分析平臺(tái)（Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2，QIIME2）和R軟件包（v4.1.2）進(jìn)行[17]。采用demux插件對(duì)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行解復(fù)用，隨后使用cutadapt插件對(duì)引物進(jìn)行切割，然后使用擴(kuò)增子序列處理方法（divisive amplicon denoising algorithm 2，DADA2）對(duì)序列進(jìn)行去引物、質(zhì)量過濾、去噪、拼接和去除嵌合體[18]。它不再以相似度聚類，只進(jìn)行去重或相當(dāng)于以100%相似度聚類。使用DADA2質(zhì)控后產(chǎn)生的每個(gè)去重序列稱為特征序列（amplicon sequence variants，ASV）。本研究中，將具有超過3 000 片段的ASV命名為“大量存在的ASV”或者“豐富ASV”，而“關(guān)鍵 ASV”是二維空間長度大于描述符的平衡圓半徑、在二維空間貢獻(xiàn)最大、將在決定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要作用的ASV。

采用β多樣性分析研究微生物群落結(jié)構(gòu)變化，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）基于物種豐度矩陣進(jìn)行降維可視化。利用元基因組分析儀軟件（MEGAN）[19]和圖解系統(tǒng)發(fā)育分析軟件（GraPhlAn）[20]，其分類學(xué)組成和豐度進(jìn)行了可視化分析。通過Metastats法[21]比較各樣品或分組在門和屬水平上的豐度并以柱狀圖展現(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性淀粉含量及交聯(lián)度的測(cè)定

沉降積與交聯(lián)度呈線性負(fù)相關(guān)，這是由于淀粉經(jīng)交聯(lián)以后其黏度和其疏水性質(zhì)有所改變所致[22]。由圖1可知，同為磷酸酯淀粉，POCl3交聯(lián)淀粉組（P組）在交聯(lián)劑用量為0.1%下可得到與STMP交聯(lián)淀粉組（S組）交聯(lián)劑用量為3%的同磷含量的交聯(lián)淀粉，這可能是由于POCl3在淀粉乳中與水結(jié)合生成的正磷酸含3 個(gè)磷酸基團(tuán)，能夠更多地進(jìn)入淀粉表面縫隙取代氫鍵，將不同的淀粉分子羥基或同一淀粉分子中兩個(gè)不同部位的羥基經(jīng)與同一個(gè)磷酸分子發(fā)生酯化反應(yīng)聯(lián)結(jié)在一起，形成酯鍵[23]。

交聯(lián)反應(yīng)前后的抗性淀粉含量如表1所示。HAMS因其較高的直鏈淀粉含量及緊密堆積的淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)使其具備較高的酶抗性[24]，其抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為60%。對(duì)于低交聯(lián)度淀粉樣品（P1、E1），其抗性淀粉含量會(huì)略有降低，這可能與它們破壞了淀粉的短程有序性有關(guān)[6]。對(duì)于中高交聯(lián)度的淀粉樣品，引入的化學(xué)鍵阻礙了α-1,6和α-1,4糖苷鍵及相鄰支點(diǎn)與淀粉酶的接觸，從而使其抗性淀粉含量較原淀粉明顯提高[25]。據(jù)報(bào)道，引入的交聯(lián)劑主要分布于淀粉顆粒表面[26]，EOH交聯(lián)淀粉組（E組）和P組相對(duì)于S組在高交聯(lián)度時(shí)有更高的抗性淀粉含量，這可能是由于POCl3和EOH為液體，導(dǎo)致它們能在淀粉-交聯(lián)劑體系中更多地到達(dá)淀粉分子顆粒表面縫隙處或擴(kuò)散至顆粒基質(zhì)中[27]，增加化學(xué)鍵取代氫鍵的程度，達(dá)到更穩(wěn)定的交聯(lián)效果[28]。

圖1 交聯(lián)淀粉沉降積Fig. 1 Sedimentation volume of chemically crosslinked starches

表1 樣品改性前后磷及抗性淀粉含量Table 1 Phosphorus and RS contents of chemically crosslinked starches

2.2 X射線衍射

圖2 化學(xué)交聯(lián)淀粉X射線衍射曲線Fig. 2 X-Ray diffraction profiles of chemically crosslinked starches

由圖2可知，HAMS為典型的B型結(jié)晶淀粉，其在15.26°、17.21°、19.75°、22.32°、24.08°有明顯的衍射峰[29]。交聯(lián)前后結(jié)晶度略有降低，這是由于堿性反應(yīng)環(huán)境和交聯(lián)劑共同作用[30]。研究表明，當(dāng)使用更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 POCl3時(shí)，一些淀粉顆粒在通道和中央空腔的表面或附近以及中央空腔周圍區(qū)域發(fā)生交聯(lián)[31]，這證明POCl3交聯(lián)淀粉結(jié)晶度降低更多。交聯(lián)前后淀粉晶型沒有改變，證明三種交聯(lián)反應(yīng)主要發(fā)生在無定形區(qū)[32]。

2.3 產(chǎn)氣量測(cè)定結(jié)果

圖3 化學(xué)交聯(lián)淀粉在體外酵解過程中的產(chǎn)氣量變化Fig. 3 Gas production during the in vitro fecal fermentation of chemically cross-linked starches

如圖3所示，F(xiàn)OS組作為本實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，其在發(fā)酵初期（0～8 h）產(chǎn)氣迅速，發(fā)酵全程產(chǎn)氣量最高（P＜0.05），與其易發(fā)酵特性一致[33]。這種快速發(fā)酵的底物，過多食用會(huì)導(dǎo)致脹氣等一系列胃腸道不適[34]。

與FOS組相比，淀粉樣品在所有發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)都顯示明顯較低的產(chǎn)氣量。交聯(lián)淀粉發(fā)酵緩慢，并且隨著交聯(lián)度的增高，其產(chǎn)氣量逐漸降低（P＜0.05），交聯(lián)對(duì)產(chǎn)氣抑制效果在E組中表現(xiàn)最為明顯，這可能是由于EOH在交聯(lián)時(shí)不僅存在淀粉顆粒表面，同時(shí)也擴(kuò)散至顆粒內(nèi)部，造成其由外到內(nèi)均勻的交聯(lián)模式[27]，增加對(duì)腸道菌群分泌酶的抵抗力，使得其產(chǎn)氣量明顯降低，這與表1中其抗性淀粉含量最高呈良好一致性。發(fā)酵后半階段（12～24 h），交聯(lián)淀粉組產(chǎn)氣量趨于一致，這可能是由于淀粉表面的致密性被破壞，交聯(lián)形成的化學(xué)鍵被分解所致。相同交聯(lián)度下，相比S組和P組，E組的發(fā)酵速率最低（P＜0.05）。這種緩慢而穩(wěn)定的發(fā)酵底物可以被腸道菌群均勻發(fā)酵，滿足遠(yuǎn)端結(jié)腸能量需求[35]。高交聯(lián)度淀粉（S3、P3、E3）在整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量最低，說明交聯(lián)度可以有效控制腸道微生物內(nèi)發(fā)酵程度。

2.4 短鏈脂肪酸產(chǎn)量

如圖4所示，經(jīng)過24 h發(fā)酵，與HAMS組和FOS組相比，交聯(lián)淀粉組的乙酸和總酸產(chǎn)量規(guī)律一致，均呈現(xiàn)隨著交聯(lián)度的增高，產(chǎn)酸量逐漸降低的趨勢(shì)。交聯(lián)淀粉的抑制產(chǎn)酸作用主要發(fā)生在發(fā)酵初期（0～8 h），這是由于交聯(lián)反應(yīng)主要發(fā)生在淀粉顆粒表面，其對(duì)細(xì)菌分泌的酶具有一定的抗性。而一旦表面的交聯(lián)基團(tuán)被微生物所破壞，其淀粉殘?jiān)鼊t可在后續(xù)階段快速發(fā)酵，這也解釋了交聯(lián)淀粉前期總酸差異大而后期差異趨勢(shì)逐漸減小的現(xiàn)象。丙酸產(chǎn)量在發(fā)酵后半階段明顯增加，可能是因?yàn)榻徊嫖桂B(yǎng)使腸道微生物在發(fā)酵初期產(chǎn)生的乙酸逐步轉(zhuǎn)化為丙酸所致[36]。

圖4 化學(xué)交聯(lián)淀粉在體外發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸量變化Fig. 4 SCFA production during in vitro fecal fermentation of chemically crosslinked starches

FOS組作為陽性對(duì)照，其丙酸產(chǎn)量在發(fā)酵末期達(dá)到最高，這與前人研究結(jié)果相一致[37]。與HAMS組相比，交聯(lián)淀粉組在低交聯(lián)度（S1、P1、E1）時(shí)均可以促進(jìn)丙酸的生成。但值得注意的是，E組相對(duì)于S組和P組，其丙酸產(chǎn)量和交聯(lián)度之間的劑量效應(yīng)關(guān)系更為明顯，這可能是醚化淀粉不含磷基團(tuán)但同時(shí)能加強(qiáng)淀粉抗性的獨(dú)特特性從而使增殖定向菌群所致。

丁酸被認(rèn)為是對(duì)人體健康有益一種短鏈脂肪酸，如抑制炎癥、抗癌、增強(qiáng)結(jié)腸屏障及減少細(xì)胞氧化應(yīng)激[38]。FOS組在整個(gè)發(fā)酵期間丁酸產(chǎn)量最低，這主要與FOS在腸道內(nèi)定向促進(jìn)雙歧桿菌的生長有關(guān)，雙歧桿菌作為優(yōu)勢(shì)菌群促使淀粉分解生成琥珀酸，進(jìn)一步通過丙酸-琥珀酸的轉(zhuǎn)化途徑生成丙酸。值得注意的是，與其他交聯(lián)淀粉抑制所有酸產(chǎn)生所不同，E組交聯(lián)淀粉顯著促進(jìn)丁酸生成（P＜0.05），且與交聯(lián)度的增加無關(guān)，這可能是由于發(fā)酵過程中醚化淀粉對(duì)菌群的特異性調(diào)控所導(dǎo)致。

2.5 物種豐度變化

圖5 化學(xué)交聯(lián)淀粉經(jīng) 24 h體外發(fā)酵后腸道菌群門（A）和屬（B）水平豐度變化Fig. 5 Changes in the abundance of intestinal microbiota at the phylum (A) and genus (B) level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starches

不同交聯(lián)淀粉發(fā)酵24 h后腸道菌群相對(duì)豐度如圖5所示，空白組為未加入樣品的原始菌群組。由門水平可知（圖5A），不同交聯(lián)淀粉均主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Fusobacteria組成，其中，F(xiàn)irmicutes占比最高。與空白組相比，F(xiàn)OS組中Actinobacteria相對(duì)豐度大幅增多，其Actinobacteria和Firmicutes數(shù)量占比達(dá)70%以上。HAMS組和交聯(lián)淀粉組的整體規(guī)律性一致，即Firmicutes與Actinobacteria相對(duì)豐度均增加，同時(shí)交聯(lián)反應(yīng)可以抑制Actinobacteria相對(duì)豐度。

為獲得細(xì)菌群落的主要差異，選取相對(duì)豐度前20的屬進(jìn)行比較（圖5B）。與空白組相比，交聯(lián)淀粉組均提高了Roseburia、Ruminococcus等有益菌的豐度。而FOS組主要促進(jìn)了Roseburia、Bifidobacterium和Bacteroides的增殖。

但不同交聯(lián)淀粉組中菌群相對(duì)豐度變化與交聯(lián)度之間的劑量效應(yīng)關(guān)系并不相同。交聯(lián)淀粉可以通過促進(jìn)產(chǎn)丁酸的共生Firmicutes積極調(diào)控腸道微生物的組成及功能[39]。Roseburia和Ruminococcus這兩種關(guān)鍵利用抗性淀粉盛產(chǎn)丁酸的厚壁菌屬，其相對(duì)豐度在E組中呈隨交聯(lián)度增加而增加的趨勢(shì)，這正是E組淀粉發(fā)酵過程中高丁酸產(chǎn)量的重要原因。

FOS組促進(jìn)偏好利用寡糖和單糖類底物的Bifidobacterium[40]大幅增長，而交聯(lián)淀粉組則無此趨勢(shì)，對(duì)于主要分解利用纖維底物的Bacteroides，S組交聯(lián)度與其相對(duì)豐度呈正相關(guān)，而E組交聯(lián)度則與其并無良好的相關(guān)性，P組淀粉交聯(lián)度與前5 位特征菌屬相對(duì)豐度均無良好相關(guān)性。

2.6 ASV水平物種豐度變化

圖6 化學(xué)交聯(lián)淀粉經(jīng)24 h體外發(fā)酵后腸道菌群ASV水平豐度變化Fig. 6 Changes in the abundance of intestinal microbiota at the ASV level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starch

為進(jìn)一步探討菌群ASV水平組成的變化，選取豐度排名前20的ASV繪制熱圖。如圖6所示，與屬水平結(jié)果一致，與初始菌群（空白組）相比，F(xiàn)OS組顯著促進(jìn)ASV-5617-Bifidobacterium（P＜0.05）。交聯(lián)淀粉組經(jīng)過24 h發(fā)酵后相對(duì)于顯著增加ASV-7474-Lachnospiraceae（P＜0.01），降低ASV-10721-Dialister與ASV-13299-Oscillospira（P＜0.01），這兩者通常與急性腸炎及一些慢性疾病有關(guān)聯(lián)[41]。

不同交聯(lián)淀粉所調(diào)控的菌群在ASV水平上的變化不完全相同。磷酸酯交聯(lián)淀粉（S組和P組）可以顯著促進(jìn)ASV-Ruminococcus增殖，EOH交聯(lián)淀粉則可以顯著促進(jìn)ASV-Roseburia增殖，這兩種厚壁菌的增殖均與交聯(lián)度正相關(guān)。間接反映了不同交聯(lián)基團(tuán)和反應(yīng)模式對(duì)菌群有不同的促進(jìn)方式。

2.7 PCA

圖7 化學(xué)交聯(lián)淀粉經(jīng) 24 h體外發(fā)酵后腸道菌群 ASV水平的PCA圖Fig. 7 Principal component analysis (PCA) plot for intestinal microbiota at the ASV level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starches

如圖7所示，2 個(gè)PC共解釋了樣本間79.4%的變化（PC1 52.4%，PC2 27%）。其中FOS組、空白組和交聯(lián)淀粉組的“關(guān)鍵ASV”在圖中存在明顯的分離，表明不同底物成分對(duì)腸道菌群組成的影響不同。其中FOS組對(duì)ASV-5617-Bifidobacterium有促進(jìn)作用，交聯(lián)淀粉組顯著促進(jìn)了ASV-8874-Ruminococcus與ASV-4517-Roseburia，這兩種均與高濃度膳食纖維攝入有關(guān)，其中乙酸和乳酸為其主要代謝產(chǎn)物，可以進(jìn)一步通過交叉喂養(yǎng)轉(zhuǎn)化生成丁酸[42]。

在交聯(lián)淀粉組中，所有磷酸酯交聯(lián)淀粉和低用量EOH交聯(lián)淀粉在PC1上的距離較近，證明其具有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)，這與菌群屬水平豐度結(jié)果一致。但中、高用量的EOH交聯(lián)淀粉（E2，E3）與磷酸酯交聯(lián)淀粉、高鏈玉米原淀粉和低用量EOH交聯(lián)淀粉有明顯差距，可以更多促進(jìn)ASV-4517-Roseburia的增長，這與其丁酸產(chǎn)量增多的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

不同交聯(lián)劑制備的化學(xué)改性淀粉在調(diào)控大腸發(fā)酵方面趨勢(shì)一致，均可有效減緩淀粉的體外發(fā)酵速率，并能促進(jìn)Ruminococcus、Roseburia等有益菌的生長。其中，EOH交聯(lián)淀粉丁酸產(chǎn)量最高且與交聯(lián)劑無劑量效應(yīng)關(guān)系，而磷酸酯交聯(lián)淀粉短鏈脂肪酸產(chǎn)量則與交聯(lián)度呈反比。STMP和POCl3交聯(lián)淀粉均隨著交聯(lián)劑用量升高，Roseburia相對(duì)豐度提升率降低，EOH交聯(lián)淀粉則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。同時(shí)，交聯(lián)能夠在發(fā)酵初期顯著抑制淀粉發(fā)酵速率。因此，化學(xué)交聯(lián)淀粉具備一定的益生元效應(yīng)，可以將更多的淀粉輸送到遠(yuǎn)端結(jié)腸進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)有益菌生長并促進(jìn)短鏈脂肪酸釋放。不同交聯(lián)基團(tuán)化學(xué)交聯(lián)淀粉可以定向調(diào)控不同菌群，且劑量效應(yīng)關(guān)系取決于所使用的交聯(lián)劑種類。