超分子雙波長共振光散射法測定半胱氨酸含量

劉 毅，袁 莉，袁嘉怡，儲 文，馬衛興,2,3,*

（1.江蘇海洋大學藥學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學生物醫藥產業學院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋藥物篩選重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

L-半胱氨酸是一種含有巰基的天然氨基酸，不僅在人體新陳代謝、蛋白折疊、酶促反應等生理過程中扮演著重要角色[1-2]，其水平異常還可能與疾病相關，例如：生長緩慢、脫發、水腫、肝臟損傷、肌肉松弛以及皮膚病變等[3-4]。同時，半胱氨酸可作為風濕性關節炎、帕金森病、阿爾茨海默癥、妊娠并發癥以及乳腺癌等癌癥的生物標志物[5-7]。半胱氨酸在食品、醫藥、化妝品行業也有著廣泛應用，例如食品添加劑[8]、肝臟藥、解毒藥[9]以及美白產品[10]等。

因此，建立省時高效的方法用于半胱氨酸的定量測定具有重要意義。目前，檢測半胱氨酸的分析方法主要有分光光度法[11-12]、熒光分析法[13-14]、電化學法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、滴定法[19-20]等，這些方法多數需要精密儀器，且操作復雜、成本較高。共振光散射技術是一種在熒光分光光度計上進行測定的分析技術，具有簡便、靈敏、快速、成本低廉等優點，廣泛應用于食品、藥品中某些成分的定量檢測[21-23]。

有研究表明亞硫酸根在堿性條件下能夠與孔雀石綠發生加成反應[24-25]，因此，半胱氨酸上的巰基也可與孔雀石綠發生加成反應。通過探索半胱氨酸-孔雀石綠體系的最佳反應條件，建立孔雀石綠單波長、雙波長共振光散射光譜法檢測半胱氨酸的新方法，并應用于保健食品L-半胱氨酸護肝膠囊和醬油中半胱氨酸的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-半胱氨酸護肝膠囊 湖北舒邦藥業有限公司；醬油為市售海天和李錦記醬油。

L-半胱氨酸（純度≥98.5%）、硼砂、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司；孔雀石綠 阿拉丁試劑（上海）有限公司。以上試劑均為分析純，超純水為實驗室超純水機制備。

1.2 儀器與設備

F-7000型熒光分光光度計 日本日立公司；BS210S分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；pHS-3C精密酸度計 上海虹益儀器儀表公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

半胱氨酸標準溶液：用超純水將L-半胱氨酸配成0.50 g/L的儲備液，放入冰箱保存。使用時用超純水稀釋100 倍配制成質量濃度為5.00 mg/L的標準溶液。

孔雀石綠溶液：稱取18.2 mg孔雀石綠溶于500 mL超純水中，制備濃度為1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液。

硼砂-氫氧化鈉緩沖液：用0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氫氧化鈉溶液混合配制成pH 9.3～10.1的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，使用酸度計測定其pH值。

待測溶液：準確加入適量5.00 mg/L半胱氨酸標準溶液、適量1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.5 mL特定pH值的緩沖溶液于10 mL比色管中，用超純水定容并搖勻，得到待測溶液，反應一定時間后用于共振光散射分析。

空白溶液：不加入半胱氨酸標準溶液，其余制備條件與待測溶液相同。

1.3.2 共振光散射分析

取適量溶液于1 cm石英比色皿中，調節儀器激發波長與發射波長相等，狹縫寬度為5 nm，在200～800 nm內掃描測定待測溶液和空白溶液得到共振光散射光譜，得到最佳波長下待測溶液的共振光散射強度（I）及空白溶液散射強度（I0），計算共振光散射強度差值（ΔI）：ΔI＝I-I0。

1.3.3 標準曲線與檢出限測定

取7 支10 mL比色管，分別加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL質量濃度為5.00 mg/L的半胱氨酸標準溶液，再向每支加入2.50 mL濃度為1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液和0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液，用超純水定容并搖勻。反應20 min后，取適量溶液進行共振光散射分析。分別計算285、338 nm波長處以及兩波長疊加時的ΔI。以半胱氨酸質量濃度（c）為橫坐標，ΔI為縱坐標，繪制出不同波長下的標準曲線：ΔI285-c、ΔI338-c及雙波長疊加ΔI285+338-c，

1.3.4 干擾實驗

按照上述方法，最佳條件下在體系中加入測定時可能存在的共存物質（其他氨基酸以及半胱氨酸膠囊中的其他物質）考察共存物質是否會干擾雙波長法的測定結果。

1.3.5 回收實驗

按照上述方法，最佳條件下用雙波長疊加法測定待測溶液和空白溶液的共振光散射強度，重復測定10 次，以雙波長回歸方程分析處理數據。

1.3.6 實際樣品測定

1.3.6.1 護肝膠囊半胱氨酸含量測定

隨機抽取市售的舒邦L-半胱氨酸護肝膠囊5 粒（半胱氨酸標示量為72 mg/粒），將膠囊的內容物取出，混合均勻后準確稱取0.138 9 g（相當于半胱氨酸5 mg）倒入250 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。過濾后棄去適量初濾液，得到續濾液。分別移取25.0 mL續濾液至100 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，得到3 組待測樣品溶液。以靈敏度較高的雙波長疊加法測定樣品溶液中半胱氨酸含量，各平行測定6 次。將本方法測定結果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]進行比較。

1.3.6.2 醬油中半胱氨酸含量測定

選擇超市購買的海天和李錦記兩種不同品牌的醬油，級別均為一級（氨基酸態氮≥0.700 g/100 mL）。分別取5.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用超純水定容并搖勻，得到醬油樣品溶液。向2 支10 mL比色管中，分別加入1.00 mL海天和李錦記醬油樣品溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液，用超純水定容并搖勻。反應20 min后進行共振光散射光譜分析。以靈敏度較高的雙波長疊加法測定樣品溶液中半胱氨酸含量，各平行測定6 次。將本方法測定結果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]進行比較。

1.4 數據處理

采用最小二乘法建立回歸方程，使用Excel處理數據，使用Origin 9.1、Chemdraw 20.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 共振光散射光譜分析

待測溶液為1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標準溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；空白溶液為2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；反應20 min后測定待測溶液及空白溶液的共振光散射光譜。如圖1所示，在285、338 nm波長處有兩個較強烈的共振光散射峰，表明孔雀石綠在硼砂-氫氧化鈉緩沖液中自身形成超分子聚合物，產生了共振光散射；加入半胱氨酸后，共振光散射更加強烈，這是因為半胱氨酸與孔雀石綠超分子聚合物發生加成反應，形成了體積更大的超分子聚合物。因此，可選擇285 nm或者338 nm單波長法測定半胱氨酸含量，也可將兩個波長處的共振光散射強度疊加使用雙波長法測定半胱氨酸含量。

圖1 待測溶液及空白溶液的共振光散射光譜Fig. 1 Resonance light scattering spectra of the sample and blank solutions

2.2 半胱氨酸-孔雀石綠體系的反應條件優化分析

2.2.1 硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液pH值及添加體積對共振光散射強度的影響

半胱氨酸-孔雀石綠體系為1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標準溶液和2.00 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液；緩沖溶液為0.5 mL不同pH值的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；反應時間為20 min。如圖2所示，在pH 9.7時，體系的ΔI最大，增加或者減小pH值，ΔI均減小。在pH 9.7條件下，不斷改變硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液的體積，結果如圖3所示，緩沖溶液的體積對體系的ΔI影響不大，曲線較平穩，當緩沖液體積為0.40～0.60 mL時，ΔI最大且穩定。因此，取中間值，選擇0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液。

圖2 不同硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液pH值下體系的ΔIFig. 2 ΔI of the system a a function of pH of borax-sodium hydroxide buffer solution

圖3 不同硼砂-氫氧化鈉緩沖添加溶液體積下體系的ΔIFig. 3 ΔI of the system as a function of volume of borax-sodium hydroxide buffer solution

2.2.2 孔雀石綠溶液添加體積對共振光散射強度的影響

在最優緩沖溶液條件下，使用1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標準溶液和不同體積（0.50～3.50 mL）1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液；反應時間為20 min。如圖4所示，ΔI隨著孔雀石綠體積增加而增大，在2.50 mL時體系的ΔI最大，繼續增加體積ΔI降低。因此，孔雀石綠溶液的最佳添加體積為2.50 mL。

圖4 不同孔雀石綠溶液添加體積下體系的ΔIFig. 4 ΔI of the system as a function of volume of malachite green solution

2.2.3 反應時間對共振光散射強度的影響

在室溫下，在最佳條件下，考察半胱氨酸與孔雀石綠的反應時間對體系共振光散射強度的影響。結果表明，隨著反應時間的延長，ΔI不斷增大，20 min時達到最大并在1 h內基本不變，說明半胱氨酸-孔雀石綠體系在20 min內反應完全，具有較好的穩定性。因此，選擇半胱氨酸-孔雀石綠體系的最佳反應時間為20 min。

2.2.4 試劑加入順序對共振光散射強度的影響

在最佳條件下，對半胱氨酸-孔雀石綠-緩沖溶液、半胱氨酸-緩沖溶液-孔雀石綠、孔雀石綠-緩沖溶液-半胱氨酸、孔雀石綠-半胱氨酸液-緩沖溶液、緩沖溶液-半胱氨酸-孔雀石綠、緩沖溶液-孔雀石綠-半胱氨酸6種加入順序進行比較。結果表明：試劑的加入順序對I和ΔI影響不大。實驗選擇半胱氨酸-孔雀石綠-緩沖溶液順序。

2.3 標準曲線與檢出限分析

本方法的線性范圍為0.10～0.60 mg/L，單波長和雙波長法對應的線性回歸方程、相關系數和檢出限如表1所示，雙波長法的檢出限更低，為0.003 23 mg/L。

表1 標準曲線相關參數Table 1 Standard curves, correlation coefficients and limits of detection of single-wavelength and dual-wavelength resonance light scattering spectroscopy

2.4 共存物質的干擾分析

由表2可知，所測共存物質均對0.50 mg/L半胱氨酸不造成干擾，相對誤差在±5%以內。因此，本方法具有良好的選擇性。

表2 干擾實驗結果Table 2 Results of interference test

2.5 精密度分析

如表3所示，方法的回收率在97.3%～102.0%之間，平均值為99.4%，相對標準偏差為0.50%。因此，本方法具有良好的精密度。

表3 回收實驗結果Table 3 Results of recovery test

2.6 實際樣品分析

2.6.1 護肝膠囊中半胱氨酸含量分析

如表4所示，本方法測定結果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]測定所得結果基本一致，且3 組樣品的相對標準偏差均小于3%，符合定量分析的要求。

表4 護肝膠囊中半胱氨酸的測定結果（n＝6）Table 4 Results of determination of cysteine in hepatoprotective capsules (n = 6)

2.6.2 醬油中半胱氨酸含量分析

由表5可知，本方法測定結果與分光光度法[11]和碘滴定法[26]測定所得結果基本一致；海天醬油、李錦記醬油中半胱氨酸的質量濃度分別為0.288 mg/L和0.257 mg/L，且相對標準偏差均在3%以內，符合定量分析的要求。

表5 醬油樣品中半胱氨酸的測定結果（n＝6）Table 5 Results of determination of cysteine in soy sauce (n = 6)

3 討 論

圖5 半胱氨酸-孔雀石綠加成反應機理Fig. 5 Mechanism of cysteine-malachite green addition reaction

圖6 超分子結構式Fig. 6 Supramolecular structural formula

最優實驗條件下，半胱氨酸與孔雀石綠物質的量比為1∶6。文獻[24-25]報道了亞硫酸根在堿性條件下與三苯甲烷類染料孔雀石綠的加成反應，是因為亞硫酸根上硫原子具有一對孤對電子才能與孔雀石綠發生加成反應。同樣，半胱氨酸分子上巰基硫原子具有兩對孤對電子，按照類比思維，半胱氨酸的巰基硫原子同樣可以與孔雀石綠發生加成反應，生成具有3 個獨立苯環的硫醚衍生物1，反應機理見圖5。在硼砂-氫氧化鈉緩沖介質中，3 個孔雀石綠分子與1 個硼酸分子上的3 個羥基分別通過分子間氫鍵形成超分子2（圖6），引起共振光散射現象，體系在波長285 nm和338 nm處形成兩個較強烈的共振光散射峰。當體系中加入半胱氨酸后，半胱氨酸首先與孔雀石綠發生加成反應形成加成反應產物1；加成產物1上的兩個叔胺氮原子和1 個伯氨氮原子分別與3 個孔雀石綠陽離子形成n→π型電荷轉移配合物，加成產物1上的1 個孤立苯環與1 個孔雀石綠陽離子形成π→π型電荷轉移配合物，加成產物1上的羧酸根陰離子與1 個孔雀石綠陽離子通過靜電引力作用形成離子締合物，這樣1 個半胱氨酸與6 個孔雀石綠陽離子反應形成體積更大的超分子3，導致體系的共振光散射強度更強；且ΔI與半胱氨酸質量濃度之間呈線性關系，據此建立孔雀石綠共振光散射光譜法測定半胱氨酸含量。

4 結 論

依據半胱氨酸與孔雀石綠在堿性條件下發生加成反應、加成產物與孔雀石綠進一步的離子締合反應和電荷轉移反應形成的超分子具有更強烈的共振光散射現象，建立了孔雀石綠共振光散射光譜測定半胱氨酸含量的新方法。建立的單波長共振光散射法和雙波長疊加共振光散射法均具有較高的靈敏度和專屬性，且省時高效、成本低廉，均符合食品中半胱氨酸定量分析的要求，其中雙波長疊加共振光散射法比單波長共振光散射法更靈敏。