一種基于雙重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

熊蘇玥，李家鵬，李金春，韋憶萱，許隨根，劉睿茜，陳 曦，王守偉，曲 超，喬曉玲

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，國家肉類加工工程技術研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

肉及肉制品的“摻假”是食品加工、流通和餐飲中存在的重要問題[1-2]，價格差異帶來的經濟利益驅使一些不法商販和企業在牛肉等高價肉制品中摻入一些低廉肉種，甚至使用一些經過違規添加劑處理后的植物源性添加物冒充高價肉，嚴重侵害消費者權益和健康[3]。因此需要建立對市售肉制品中牛源性成分精準定量的檢測方法，以判定摻假的類型及嚴重程度，解決定性檢測中無法區分污染和惡意摻假的假陽性問題。

國內外關于動物源性成分檢測除了傳統理化檢測技術，主要還有基于蛋白質的檢測技術以及DNA的分子生物學檢測技術[4]，其中分子生物學技術以其檢測靈敏度高、重復性好、準確度高等優勢，適用于經各種加工條件處理后成分復雜的肉制品中肉成分的檢測[5-6]。目前已有大量關于基于普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的定性方法和基于real-time PCR的相對定量檢測方法的研究報道[7-9]，但相對定量方法需要基于標準曲線才能實現定量，同時real-time PCR的標準曲線需依賴于Ct值，引物設計或擴增條件的細微差異都可能影響PCR擴增效率，進而導致定量的不準確[10]。

微滴式數字聚合酶鏈式反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術是近年來發展起來的定量分析技術，通過將PCR體系分配到約2萬 個獨立的反應液滴中并且發生擴增反應，統計每個獨立微滴中的陽性信號結合泊松分布原理，對模板中核酸的拷貝數進行絕對定量[11]，避免了樣品差異性及擴增效率變化而導致的定量結果不準確[12]。目前ddPCR技術已廣泛應用于轉基因檢測、致病菌微生物檢測、拷貝數變異分析以及疾病診斷等領域[13-16]。近年來，隨著ddPCR及其他分子生物學技術的不斷發展和日趨完善，陸續有研究將ddPCR技術應用于肉類食品成分定量分析，李偉琦等[17]比較了ddPCR與芯片式PCR在火雞源性成分定量檢測中的差異，發現兩種檢測方法對5%及以上含量樣品的檢測數據具有一定的穩定性和可重復性。劉立兵等[18]以提取的樣品DNA濃度為中間值，建立其與DNA拷貝數和目標肉樣質量之間的兩組標準曲線，從而實現對雞、豬、牛源性成分的精準定量，相比于Koppel等[19]開發的realtime PCR定量檢測方法中對雞肉及豬肉含量定量方法相對標準偏差更小；通過直接建立拷貝數與質量分數之間的關系，Ren Junan等[20]實現了羊肉中摻雜豬肉或雞肉成分的ddPCR精準定量檢測方法，發現該方法比定量PCR的檢測結果更接近真實值，相對標準偏差更低。但由于市場上肉制品中混合成分多樣，摻假肉源種類眾多，除常見的低價禽畜肉類外，更有甚者會摻入一些貉子肉等不能食用的動物肉以次充好，或者選擇植物源性添加物增加質量。因此，固定的檢測某類摻假物質會降低檢測摻假效率，加大工作量，有待開發可同步檢測多種肉類的檢測方法。

本研究建立雙重ddPCR體系，同時擴增牛源性成分與動物源性成分，除了對牛源性成分進行定量檢測，還可以通過ddPCR雙通道拷貝數比值，判斷是否存在牛肉源性之外動物源性成分參與通用引物的擴增，以期為打擊肉類產品摻假售假等違法違規行為提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、狗肉、狐貍肉、貉子肉、鹿肉、驢肉、胖頭魚肉、馬肉 市購；貓血、鼠血在北京某寵物醫院采集；牛肉丸、牛排等牛肉制品北京某超市。

Droplet Generation Oil for probes 美國Bio-Rad公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）美國Bio-Rad公司；Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒 上海凱杰有限公司；SYBR Green Enzyme Premix 羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

ddPCR系統（QX200微滴生成儀、C1000 PCR儀、QX200微滴讀取分析儀） 美國Bio-Rad公司；5415R高速冷凍離心機 德國Eppendorff公司；OMNI Prep多樣品剪切均質勻漿機 美國OMINI公司；Nanodrop2000微量核酸蛋白檢測儀 Thermal中國有限公司；LightCycler 480實時熒光定量PCR儀 羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針的設計

從NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）下載目標物種牛（NC_037352.1）及其他動物的單拷貝基因序列β-actin，將目標物種與其他動物源性物種基因序列進行比對（MEGA 6.0），選擇差異序列用于設計特異性引物和探針，保守區域用于通用引物和探針的設計。用HEX熒光染料基團標記牛源性探針的5’端，FAM熒光染料基團標記動物源性探針的5’端，非熒光淬滅基團均采用BHQ標記，引物和探針均由Invitrogen公司合成，詳細序列見表1。

表1 用于多重ddPCR的引物Table 1 Primer sequences used for multiplex PCR

1.3.2 樣品前處理

參考Noh等[21]的方法，取樣品的肌肉組織于組織勻漿機中絞碎后80 ℃烘干72 h，再用粉碎機研磨成粉，勻質過程中不同肉類分開處理，防止樣品間交叉污染。

1.3.3 DNA提取

參考Santella[22]采用CTAB法提取基因組DNA，分別準確稱取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg的牛肉粉末作為實驗的標準品，加入800 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，56 ℃水浴1 h后12 000 r/min離心5 min；吸取上清液600 μL，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，混勻后12 000 r/min離心5 min；吸取上清液400 μL，加入80%體積的異丙醇，混勻后常溫靜置沉淀30 min，12 000 r/min離心5 min。棄掉上清液，加入500 μL的70%乙醇溶液洗滌沉淀2 次，12 000 r/min離心5 min；棄去上清液，室溫下自然干燥后加入TE緩沖液100 μL溶解DNA。

1.3.4 引物和探針的設計與特異性評價

利用鼠、牛、羊、豬、馬、鹿、狐貍、貓、狗、魚、雞、鴨、貉子和驢共14 個物種所提取的基因組DNA，采用real-time PCR技術進行相應引物、探針的特異性和通用性驗證。所用的10 μL的real-time PCR體系包含：LightCycler 480 Probe Master 5 μL，DNA 模板2 μL（質量濃度為5 ng/μL），上下游引物（10 nmol/μL）0.6 μL，探針（10 nmol/μL）0.3 μL，ddH2O 1.5 μL。realtime PCR條件： 95 ℃預變性5 min， 95 ℃變性15 s，64 ℃退火、延伸45 s，40 個循環，同時連續檢測熒光強度。

1.3.5 ddPCR退火溫度優化

如表2所示，兩種引物和探針的終濃度均為900 nmol/L和200 nmol/L。將加入DNA模板后的反應液轉移到微滴生成卡中，加入70 μL液滴生成油，生成微滴。將生成的40 μL微滴轉移至96 孔板中，封膜后放入C1000 PCR儀中進行擴增。為考察擴增退火溫度對讀取拷貝數定量結果的影響，采用不同的退火溫度以優化PCR，以20 ng/μL牛DNA為模板，PCR條件： 95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，于不同溫度60、61、62、63、64 ℃退火、延伸1 min，共40 個循環；98 ℃、10 min，升降溫速率為2 ℃/s。

表2 雙重ddPCR體系組分及配比（總體積20 μL）Table 2 Composition of ddPCR system (total volume of 20 μL)

1.3.6 牛肉質量與拷貝數換算公式的確定

1.3.6.1 牛肉質量與DNA質量濃度的線性關系

分別稱量5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg共10 個質量梯度的牛肉樣品提取DNA，每個梯度重復3 次。提取完成后采用NanoDrop2000核酸定量測定儀測定DNA質量濃度與純度，以3 個平行的DNA質量濃度平均值（ng/μL）為縱坐標，使用Excel擬合標準曲線，得到牛肉質量-DNA質量濃度的線性關系式。

1.3.6.2 DNA質量濃度與拷貝數的線性關系

將提取的牛DNA按比例稀釋后，用NanoDrop2000核酸定量測定儀測定稀釋后的DNA質量濃度與純度，最終得到5、10、24、48、73、96、145、200、260、300 ng/μL 10 個不同質量濃度梯度的牛DNA。按照優化后的擴增條件進行擴增，使用微滴分析儀和QuantaSoft V1.3.2軟件對ddPCR擴增產物進行檢測和分析。每個體系的有效微滴數應高于12 000 個微滴，以滿足泊松統計的需求，記錄有效的拷貝數濃度（C），每個梯度3 個重復，分別計算其平均值，使用Excel擬合DNA濃度與拷貝數濃度之間的標準曲線。同時通過雙通道拷貝數比值計算樣品中牛源性成分在動物源性成分中的拷貝數相對含量，計算公式如下：

1.3.7 ddPCR的抗干擾及適用性實驗

1.3.7.1 定量方法對混合牛肉樣品的抗干擾驗證

為驗證所建ddPCR方法對外源性物種的抗干擾性，以總質量為50 mg，分別稱量不同質量的牛肉與豬肉制成9 個質量分數（10%～90%）的混合樣品，同時選取羊肉、驢肉、馬肉、貉子、狐貍肉、雞肉和鴨肉7種其他肉樣與牛肉按照質量比2∶3制成兩兩混合樣品。提取混合肉樣DNA后進行雙重ddPCR檢測。分別對樣品中的牛源性成分進行定量檢測，并計算雙通道拷貝數相對含量。

1.3.7.2 定量方法對不同牛肉樣品的適用性驗證

為驗證所建ddPCR方法對不同鮮切牛肉產品的適用性，分別從某市場中購買牛五花趾、牛匙柄、黃牛腿肉、黑牛腱子、黑牛吊龍等10 件不同部位、不同品種的牛肉鮮切產品。在線性范圍內，分別稱取每個產品10、25、40 mg 3 個不同質量梯度，對產品中的牛源性成分進行定量檢測，并計算雙通道拷貝數相對含量。

1.3.8 市售樣品的檢測

分別從某市場中購買牛肉及豬肉（牛肉丸、牛排、豬肉丸等）等15種不同類型的成分復雜的肉制品，提取DNA后利用建立的ddPCR方法對肉制品中牛源性成分質量進行檢測，以驗證所建立的ddPCR實際檢測效果。

2 結果與分析

2.1 引物和探針的設計與驗證

采用14種物種的DNA驗證牛源性引物的特異性及用動物源性引物的通用性，擴增結果如表3所示，14種物種中僅有牛DNA為模板時，可在牛源性特異引物擴增時出現擴增曲線，其他物種均無熒光信號值的增加。證明所設計的引物對食品中常見的肉種有良好的特異性，不會擴增出食品中常見的非牛動物源性成分，以免干擾定量的精準性。同時，動物源性通用引物擴增時，僅有空白對照組未出現擴增曲線，說明該通用性引物能夠用于常見動物源性成分檢測。

表3 real-time PCR特異性引物檢測結果Table 3 Results of specific primer test by real-time PCR

2.2 ddPCR擴增條件優化

當退火溫度為60、61、62、63、64 ℃時，檢測結果如圖1所示，藍色散點為FAM通道1中通用性引物擴增成功的目標微滴，拷貝數濃度為（104±3）copies/μL，灰色散點為未發生擴增或發生非特異性擴增，熒光強度低相對較低的非目標微滴，不參與計數；綠色散點為HEX通道2中特異性引物成功擴增的目標微滴，拷貝數濃度為（106±4）copies/μL。所有退火溫度均能有效區分陰性和陽性微滴點，但在FAM通道1中，隨著擴增溫度的下降，動物源性通用引物出現的非特異性擴增的液滴數量上升。在模板濃度更高的情況下，可能會干擾目標基因的正常讀數，因此選擇64 ℃作為該牛源性-動物源性成分雙重ddPCR體系的退火溫度。

圖1 不同退火溫度下雙重ddPCR雙通道中拷貝數1D散點圖Fig. 1 1D scatter plots of copy number in two channels of ddPCR system at different annealing temperatures

2.3 肉樣質量與拷貝數計算公式

2.3.1 目標肉樣質量與DNA質量濃度的關系

牛肉質量在5～50 mg范圍內，牛肉質量與提取的DNA質量濃度有顯著的線性關系：y1=6.926 1x1-17.167；R2=0.998 1，其中，x1代表牛肉的質量（mg），y1代表所測得的DNA質量濃度（ng/μL）。

2.3.2 DNA總量與DNA拷貝數的關系

在Beta-actin單拷貝基因靶標體系下，ddPCR檢測過程中每個樣品的微滴生成均在12 000以上，滿足了泊松分布計算的要求，且DNA總量與其所生成的DNA拷貝數之間有顯著的線性關系：y2=4.389 2x2+3.392；R2=0.998 5。其中，x2代表所加模板DNA總量（ng），y2代表每微升的DNA特異性擴增拷貝數（copies/μL）。

同時，在以不同質量濃度牛肉DNA為模板擴增時，特異性引物擴增的拷貝數與通用引物擴增的拷貝數比值為1.00±0.04，表明在檢測樣品中，牛肉在動物源性成分中的相對含量為小于或等于（100±4）%，該誤差范圍包括機器微滴讀取與泊松分布計算誤差（＜5%），符合樣品含有100%牛肉的樣品性質。

2.3.3 肉樣質量與拷貝數換算公式的確定結果

根據目標肉樣的質量與所提取DNA質量濃度之間的線性關系及DNA質量濃度與所測定DNA特異性擴增拷貝數之間的線性關系，選擇DNA質量濃度作為中間值，推導出目標肉樣的質量與特異性擴增拷貝數之間的關系式M牛=0.033C牛+2.37，因此可通過測定DNA特異性擴增拷貝數，計算檢測樣品中牛源性成分的質量。其中，M牛為牛源性成分的質量（mg），C牛為每微升的DNA特異性擴增拷貝數（copies/μL）。

2.4 ddPCR抗干擾實驗和適用性驗證

2.4.1 ddPCR的抗干擾實驗結果

在牛肉與其他肉類制成兩兩混合樣品中，牛肉定量檢測數值與實際質量基本一致（表4），且隨著牛肉的實際質量由5 mg上升至45 mg，定量檢測值準確性逐漸提高，相對標準偏差由12.68%降低為1.33%，說明該方法對牛肉源性成分的定值基本準確。而得到的拷貝數相對含量與牛肉實際相對含量存在明顯的偏差。由牛、豬肉兩兩混合樣品的檢測結果可得，在牛肉實際相對含量為10%時，牛肉檢測相對含量僅為2.52%，隨著牛肉含量的上升，拷貝數相對含量與實際含量相差逐漸縮小。

這可能是由于相同質量下，豬肉中提取到的可參與通用性引物擴增的核酸分子含量高于牛肉，在大量豬肉成分存在時，通用引物的拷貝數相對提升較多，導致拷貝數相對含量明顯低于理論值。相反的情況則出現在存在雞、鴨源性成分時，這兩種非牛源性成分在通用性引物擴增時得到的拷貝數較低，使牛肉相對含量高于理論值。這表明通過雙通道擴增拷貝數比值計算得到的相對含量是否小于（100±4）%僅可以判斷樣品中是否存在非牛源性成分，但無法對其他動物源性成分進行定性及定量檢測。

表4 已知質量的混合肉樣的ddPCR定量分析Table 4 Results of ddPCR for known mixed meat samples

2.4.2 ddPCR的適用性驗證

采用建立的雙重ddPCR方法對不同品種、不同部位的牛肉進行10、25、40 mg 3 個不同質量梯度的定量鑒定。如表5所示，10 個不同部位的定量結果在10、25、40 mg 3 個不同質量梯度時，平均值分別為9.75、26.30、36.16 mg，相對標準偏差分別為-2.52%、5.20%、-9.60%，可見不同牛肉部位的檢測結果相對偏差隨著質量的增加而升高。這可能是由于不同部位或品種的樣品，相同質量下的細胞含量有所差異，不同組織成分在制成干粉后DNA提取效率也不盡相同，導致擴增后的定量結果產生了一定的偏差。

所有樣品通過擴增雙通道中特異性引物與通用性引物的擴增拷貝數之比，得到的拷貝數相對含量為92.59%～99.01%，與牛肉實際相對含量100%基本相符，部分略低于95%的樣品如牛匙柄、黑牛里脊等鮮切產品，可能是由于超市加工環節或者樣品流通中的無意沾染造成的誤差。

表5 不同部位、不同品種牛肉樣品的ddPCR定量分析Table 5 Results of ddPCR for beef samples from different body parts and species

2.5 市售肉制品中牛肉成分的檢測結果

利用本研究建立的雙重ddPCR方法，對于成分復雜、肉種多樣的市售肉及肉制品進行定量鑒定（表6）。結果表明，在明確標注牛肉含量的第1～4號產品中，檢測結果均基本符合產品標注；而部分市售肉制品存在部分含量不足及摻假現象，如第6、10號產品中，牛肉定量檢測的質量分數為3.00%與4.30%，說明該類樣品中的牛肉含量過低，同時檢測拷貝數相對含量為55.56%與98.04%，分別符合6號產品中含有其他動物源性成分以及10號產品中僅牛肉的標注；對7號樣品鮮牛肉餡的檢測發現，牛肉定量檢測的質量分數為77.55%，拷貝數相對含量為81.97%，排除超市可能出現混裝柜臺或者共用絞肉機等器具造成的誤差，該牛肉餡樣品仍可能存在一定的摻假情況。13～15號樣品為豬肉丸，該類樣品未檢測到牛源性成分，說明所建立的ddPCR體系在復雜的食物基質中檢測時可保持良好特異性。

表6 市售樣品的ddPCR定量分析Table 6 Results of ddPCR for commercial beef samples

3 討 論

目前，食品安全和食品原料成分摻假等問題已經引起越來越多的關注[23]，real-time PCR作為現在監管部門對肉制品鑒別的常用技術手段，已漸漸不能滿足目前市場出現的各類復雜摻假現象的檢測和監管。大量研究表明ddPCR相比于real-time PCR，尤其在在檢測低含量的核酸成分時，具有更高的準確度和靈敏度[24-26]。

市售肉制品存在原料肉種類多樣，添加劑成分復雜等情況，一些肉制品多含有凝膠等添加劑，使得部分ddPCR檢測方法檢測準確性受限[27]，劉立兵等[28]建立的鴨源性成分ddPCR定量檢測方法中，發現在選取鴨皮膚、脂肪或內臟等部分，而非鴨紅肉部分作為樣品進行檢測時，會導致誤差升高。同時肉制品在生產加工過程中通常會受高溫、高壓等條件影響，目的DNA可能會出現含量降低、高度片段化等現象，增加檢測難度[29]。本研究建立的檢測體系主要著眼于市售肉及肉制品，通過檢驗市場上多種不同類型的肉制品進行取樣實驗，結果顯示無論在肉樣兩兩混合還是復雜的食品基質中，對牛源性成分的檢測都與實際質量基本一致，也發現了市場上的確存在部分摻假產品。

目前已有研究主要針對市場某些常見肉類摻假模式[30-31]，苗麗等[32]建立了一種基于ddPCR技術的牛肉與豬肉的檢測方法，可針對性的對牛肉中摻入的豬肉進行定量分析。劉立兵等[33]通過ddPCR技術分別對牛GH基因和豬PRNP基因的拷貝數進行檢測，采用固定比值法準確檢測到樣品中豬肉源性成分的質量分數。René等[34]通過建立雙重ddPCR對不同的熒光信號進行讀取，每個雙重ddPCR體系可實現對羊、馬、雞等多種動物源性成分中的兩個物種的準確定量。然而，這類方法僅適用于2種肉類混合的樣本，而市售肉制品中常含有多種肉源性成分。為增加檢測肉品種類，趙新等[35]引入內參基因，通過進行羊種屬特異性和動物源性通用性的拷貝數濃度兩次檢測，在一定摻假范圍內，可準確定量摻有雞、鴨、豬等多種鮮凍畜、禽肉產品中羊源性成分質量分數。但目前尚無包含通用動物源性成分的雙重ddPCR檢測方法，本研究所建立的基于ddPCR檢測技術的雙通道檢測技術，利用牛特異性擴增與動物源性通用性擴增的拷貝數之比，擴大了對摻假肉類種類的檢測范圍，可判斷是否存在非牛源性的其他動物成分。

另一方面，在檢測牛肉與不同物種混合樣品時，發現不同物種在相同的樣品質量下，肌肉細胞數乃至DNA提取效率不盡相同[36]，導致動物源性成分通用引物在擴增各物種DNA時，拷貝數與樣品質量不成比例，這與楊華等[37]建立的檢測牛源性成分的雙重ddPCR結果一致，在樣品中摻入雞肉、鴨肉和豬肉不同肉源性成分后，其DNA拷貝數之比難以計算出其準確的組分質量比。在相同物種的不同部位，也存在拷貝數濃度差異較大的情況，紀藝等[38]通過研究鴨的不同品種及不同部位生鮮組織的拷貝數變異系數，發現檢測核DNA時，鴨心或鴨血相較于肌肉組織較多的鴨腿部分，定量值的變異系數由4.1%升高至21%以上。因此，目前還不能通過對樣品中不同肉源性成分的DNA拷貝數比計算出其組分的質量比，存在無法對摻假肉種類定性、定量檢測的不足之處。有待通過挖掘各物種間通用性引物擴增差異進一步改善，或建立擴增不同熒光值的靶標[39]區分不同物種ddPCR方法。