不同釀酒酵母對芒果白蘭地香氣的影響

顏家慶，張嬌嬌，郭炳豪，韓興林，沈世明，孫志偉，徐曉玲*，江 偉，黃科瑞，劉 芳

（1.百色學院 農(nóng)業(yè)與食品工程學院，廣西 百色 533000；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

白蘭地是一種蒸餾酒，以水果為原材料，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、貯藏以及陳釀而成[1]。香氣物質(zhì)的種類及其含量是評價水果白蘭地品質(zhì)高低的一個重要指標，也是水果白蘭地中重要的功能性組成成分[2-3]。不同品種的水果釀造出來的白蘭地香氣成分千差萬別，而相同品種釀造而成的白蘭地的香氣成分也會受到釀酒原料、發(fā)酵工藝、蒸餾工藝以及橡木桶陳釀等多種因素的影響[4-6]。近幾年來，關于白蘭地香氣成分的研究較多。如劉其聳[7]對張裕白蘭地蒸餾過程香氣物質(zhì)變化規(guī)律的研究，通過白蘭地蒸餾前后成分的差異，發(fā)現(xiàn)一次蒸餾液比二次蒸餾液的香氣成分多15種。畢蕓杰[8]研究葡萄品種、陳釀時間與橡木制品對白蘭地香氣成分的影響，發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種、陳釀時間與榆木制品對白蘭地香氣成分的影響有顯著性差異。

芒果（Mangifera indicaLinn）又名“杧果”、“面果”、“檬果”等，原產(chǎn)地于印度和馬來西亞，為漆樹科芒果屬芒果種多年生植物[9]。芒果具有很高的營養(yǎng)價值，其胡蘿卜素、維生素C（vitamin C，VC）和硒的含量分別是蘋果的45～104倍、3～10倍和2～12倍，VB1、VB2的含量與柑桔和菠蘿相當，素有“熱帶果王”的美譽[10-11]。由于其富含硒，因而被稱為“抗癌之王”[12]。同時，芒果還含有芒果甙、槲皮素等成分，具有祛疾止咳的功效。《綱目拾遺》指出芒果能益胃氣、止嘔暈[13]。然而，由于芒果屬于熱帶水果，采后生理代謝旺盛，且對低溫敏感，易遭受冷害，不耐貯藏。所以我國芒果的銷售主要集中在中、低檔市場，價低傷農(nóng)且由于上市時間集中導致季節(jié)性過剩[14-15]。將芒果釀造成白蘭地可以有助于減少原料浪費，提升芒果副產(chǎn)值[16]。桂七芒果是廣西百色市特色芒果品種，有“肉質(zhì)嫩、甜度高、香氣足”等特點，是釀造芒果白蘭地的絕佳原料。

本研究以桂七芒果為原料，分別以6種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發(fā)酵劑制備芒果白蘭地，進一步采用感官評價和氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（gas chromatography-hydrogen flame ionization detector，GC-FID）對芒果白蘭地的香氣和揮發(fā)性成分進行分析，研究不同釀酒酵母對芒果白蘭地風味的影響，為芒果白蘭地釀酒酵母的選擇和工藝優(yōu)化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂七芒果、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Marquise（M型）（發(fā)酵速度快速、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可在極端環(huán)境下進行酒精發(fā)酵）、Persane（P型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量非常低，可產(chǎn)生大量芳香化合物如2-乙酸苯乙酯、苯乙酸酯等）、Authentique（A型）（發(fā)酵速度和揮發(fā)酸產(chǎn)量中等，可開發(fā)出水果的復合香氣）、Raffinee（R型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可開發(fā)發(fā)酵酯和品種香氣釋放果味和復雜香氣）、Eclatante（E型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可最大限度表達硫醇品種和萜烯品種的芳香）、Italica CR1（C型）（發(fā)酵速度極快、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，在＜10 ℃下接種，此酵母具有很高地滲透性，可以增強水果品種和風土的典型芳香特征）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

果膠酶（酶活力≥60 000 U/mL）：上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司；L（+）-抗壞血酸（分析純）：江蘇宜昊添生物科技有限公司；白砂糖：市售。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TurboMatrix40氣相色譜儀：上海珀金埃爾默股份有限公司；ICS-3000離子色譜儀：美國戴安公司；JJ1000電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；HX-PB915多功能料理機：佛山海迅電器有限公司；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；5-21R離心機：湖南恒諾儀器設備有限公司；玻璃蒸餾器、SKG1601電陶爐：廣東艾詩凱奇有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果白蘭地加工工藝流程及操作要點

芒果→挑選清洗→預處理→打漿→果膠酶處理→含糖量調(diào)整→接種酵母→發(fā)酵→離心→蒸餾→原芒果白蘭地

操作要點：

（1）預處理：將新鮮成熟的芒果清洗后進行去皮去核處理，切成1 cm3左右的小方塊，將其浸泡在含抗壞血酸的溶液（50 mg/L）中，進行護色處理。

（2）果膠酶處理：主要是對芒果果漿中的果膠進行酶解，果膠酶添加量為50 μL/L，在50 ℃下酶解3 h。

（3）糖度調(diào)整：用白砂糖將芒果果漿糖度調(diào)整至28°Bx。

（4）酵母接種：調(diào)整糖度后的芒果果漿進行酵母接種，酵母需要提前活化，即將酵母放入燒杯，加入20 mL蒸餾水，放至35 ℃的恒溫水浴鍋中活化15 min，酵母接種量為0.20 g/L。

（5）發(fā)酵：將接種酵母后的芒果果漿放置于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵7 d。

（6）離心：將發(fā)酵結束的芒果醪液于6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，得到芒果果酒。

（7）蒸餾：采用夏朗德壺式蒸餾器進行二次蒸餾，得到原芒果白蘭地，酒精度為40%vol～43%vol。

1.3.2 白蘭地香氣描述詞的確定

在白蘭地香氣圖譜建立的過程中，首先要找出較好概括該類型產(chǎn)品風格特點的描述詞，在此根據(jù)中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院技術人員品評結果，最終確定了芒果白蘭地特征風格描述詞，如表1所示。

表1 芒果白蘭地特征風格描述詞[17]Table 1 Characteristic style descriptors of mango brandy

1.3.3 白蘭地香氣圖譜的建立

選5名專業(yè)品評人員在白酒品評室內(nèi)對6種芒果白蘭地進行感官品評，將白蘭地依次倒入50 mL的標準品評杯中品嘗。每次品嘗微量，品嘗完漱口進行下一芒果白蘭地品嘗，按照表1風味描述詞打分。將打分結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并繪制香氣圖譜。打分標準如下：

0—沒有味道；1分—剛能察覺，難以辨識；2分—非常輕；3分—較輕；4～5分—中等；6～7分—較強；8～9分—主導。

1.3.4 氣相色譜-氫火焰離子化檢測器分析

GC條件：CP-WAX 57 CB毛細管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為高純氮氣（N2）；流速1 mL/min，分流比10∶1；氫氣流速45 mL/min；空氣流速450 mL/min；檢測器溫度270 ℃；進樣器溫度240 ℃；進樣量1 μL。

升溫程序：起始溫度35 ℃恒溫6 min；以4 ℃/min升至60 ℃，以6 ℃/min升至110 ℃，恒溫3 min；以6 ℃/min升至205 ℃，繼續(xù)恒溫13 min。

定性方法：將乙醛、丙醛、異丁醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、仲丁醇、正丙醇、正己醛、異丁醇、2-戊醇、正丁醇等62種目標化合物用100%乙醇逐步稀釋、分析檢測，建立標準工作曲線。

定量方法：采用內(nèi)標法定量，內(nèi)標物選用叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸，向待測樣品中加入100 μL的1%內(nèi)標溶液，混勻后進樣分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2013和SPSS22.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），并對數(shù)據(jù)進行處理和分析。利用Origin 2018軟件進行主成分分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 不同酵母菌株對芒果白蘭地香氣圖譜的影響

采用酵母Marquise、Persane、Authentique、Raffinee、Eclatante、Italica CR1釀造得到的原白蘭地樣品依次編號為M、P、A、R、E、C。對6株酵母菌株釀造的芒果白蘭地感官品質(zhì)進行評價后繪制香氣雷達圖，結果見圖1。

圖1 不同酵母菌株制備芒果白蘭地感官評價雷達圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of mango brandy prepared by different yeast strains

由圖1可知，6株酵母菌株釀制的芒果白蘭地整體風格得分由高到低依次為C＞M＞P＞R＞E＞A。C型酵母釀制的芒果白蘭地得分最高，其酒澄清透明，酒香醇和，酒質(zhì)甘冽，具有芒果清香。M型酵母和E型酵母的醇香與花香評分較高，但有硫臭味、口感不協(xié)調(diào)等導致分值較低，P型酵母和R型酵母復合酯香與醇香評分較高，但酒體粗糙，口感苦澀，A型酵母整體評分比其他酵母低且有異味，酒體粗劣。因此，從圖譜的角度來看，C型酵母釀制的芒果白蘭地品質(zhì)較佳。

2.2 不同酵母菌株釀造的白蘭地的揮發(fā)性成分分析

進一步利用GC-MS測定6種芒果白蘭地的揮發(fā)性成分，不同種類揮發(fā)性成分測定結果見圖2。

圖2 不同酵母菌株對芒果白蘭地中揮發(fā)性風味成分的影響Fig.2 Effect of different yeast strains on volatile flavor components in mango brandy

由圖2可知，共檢測得到5大類揮發(fā)性化合物，6種芒果白蘭地中揮發(fā)性化合物含量由高到低依次為M＞R＞P＞A＞C＞E。6種酵母所釀制的芒果白蘭地的酸類和醇類物質(zhì)是揮發(fā)性成分中主要的物質(zhì)，占總揮發(fā)性化合物總量的60%以上。酯類物質(zhì)和醛酮類物質(zhì)占總揮發(fā)性化合物總量的31%，而芳香類物質(zhì)占比最低，不到1%。

2.2.1 酸類化合物分析

有機酸物質(zhì)對酒品發(fā)酵過程中的微生物抑制和酒的風味有重要影響，含酸量少的酒味道寡淡；但如果酸味過大，又會影響酒的風味和品質(zhì)[18]。有機酸的產(chǎn)生主要來自于水果發(fā)酵過程中醛類物質(zhì)的氧化，其濃度主要取決于未發(fā)酵水果汁的初始發(fā)酵條件[19]。不同的有機酸在酒的風味形成中既發(fā)揮各自獨特的作用，又會相互協(xié)調(diào)，是形成白蘭地獨特風味的重要成分[20]。不同酵母菌株對芒果白蘭地酸類化合物的影響見圖3。

圖3 不同酵母菌株對芒果白蘭地酸類化合物的影響Fig.3 Effect of different yeast strains on acids in mango brandy

由圖3可知，6種白蘭地中的酸類化合物含量由高到低依次為C＞A＞R＞M＞P＞E。蘋果酸、乳酸在6種白蘭地中貢獻較大，占總酸含量的81.98%，蘋果酸含量中C型酵母與P型酵母、A型酵母、R型酵母、E型酵母沒有顯著性差異（P＞0.05），乳酸含量中C型酵母與M型酵母、P型酵母、R型酵母、E型酵母有顯著性差異（P＜0.05），與A型酵母沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.2 醇類化合物分析

醇類通常為原料在發(fā)酵的過程中，通過酵母的發(fā)酵代謝使發(fā)酵汁中的糖和氨基酸轉(zhuǎn)化為醇，然后經(jīng)過蒸餾過程，進入到原白蘭地中[21-22]。不同酵母菌株對芒果白蘭地醇類化合物的影響見圖4。由圖4可知，6種白蘭地中的醇類化合物含量由高到低依次為M＞A＞R＞P＞E＞C。6種白蘭地中，甲醇、正丙醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇在白蘭地中貢獻最大，是白蘭地香氣組成中非常重要的幾類化合物，也是構成白蘭地骨架香氣的一部分[21]。異戊醇含量中M型酵母與P型酵母、R型酵母、E型酵母、C型酵母、A型酵母有顯著性差異（P＜0.05），異丁醇含量中R型酵母與P型酵母、A型酵母沒有顯著性差異（P＞0.05），正丙醇物質(zhì)含量中C型酵母與P型酵母、A型酵母、E型酵母、R型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 不同酵母菌株對芒果白蘭地醇類化合物的影響Fig.4 Effect of different yeast strains on alcohols in mango brandy

2.2.3 酯類化合物分析

酯類物質(zhì)是白蘭地揮發(fā)性成分中最為豐富的物質(zhì)，是由酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)在蒸餾過程中經(jīng)過一系列的酯化反應生成[23-24]。乙酸乙酯是6種白蘭地中含量最高的酯類物質(zhì)，也是白蘭地的骨架香氣成分之一[25-26]。乙酸乙酯具有香蕉、蘋果香氣，芳香帶甜味[27]。不同酵母菌株對芒果白蘭地酯類化合物的影響見圖5。由圖5可知，6種白蘭地中的酯類化合物含量由高到低依次為P＞E＞R＞M＞A＞C。6種白蘭地中貢獻較大的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、乙酸異戊酯，同時這2種物質(zhì)也是白蘭地中骨架香氣中比較重要的酯類物質(zhì)。對于乙酸乙酯含量，C型酵母與E型酵母、R型酵母、P型酵母有顯著性差異（P＜0.05）；對于乙酸異戊酯含量，E型酵母與C型酵母、A型酵母、M型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同酵母菌株對芒果白蘭地酯類化合物的影響Fig.5 Effect of different yeast strains on esters in mango brandy

2.2.4 醛酮類化合物分析

醛酮類物質(zhì)是構成白蘭地整體香氣不可或缺的重要組成部分[28]。不同酵母菌株對芒果白蘭地醛酮類化合物的影響見圖6。由圖6可知，6種白蘭地中的醛酮類化合物含量由高到低依次為M＞P＞R＞E＞C＞A。乙醛和乙縮醛是6種白蘭地中共有的醛酮類物質(zhì)化合物，也是6種白蘭地含有的醛酮類物質(zhì)中貢獻最大的化合物。乙醛含量中E型酵母與C型酵母、A型酵母、R型酵母有顯著性差異（P＜0.05），乙縮醛含量中M型酵母與E型酵母、A型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。但乙醛在這6種白蘭地中醛酮含量最高。相關的研究表明，白蘭地中的醛酮類化合物可能來源于水果原料，或釀造白蘭地的過程中，且這些醛酮類化合物對白蘭地的風味有重要影響[29-30]。

圖6 不同酵母菌株對芒果白蘭地醛酮類化合物的影響Fig.6 Effect of different yeast strains on aldehydes and ketones in mango brandy

2.2.5 芳香類化合物分析

不同酵母菌株對芒果白蘭地芳香類化合物的影響見圖7。由圖7可知，6種白蘭地中的芳香類化合物含量由高到低依次為R＞P＞M＞E＞A＞C，主要表現(xiàn)在芳香類化合物含量的差異性。苯乙醇在這6種白蘭地中含量較高，R型酵母與A型酵母、C型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。苯乙醇有清甜的玫瑰花香[31]，有研究認為苯乙醇起主要的作用[32-33]，R型酵母中的苯乙醇含量最高，苯甲醛是白蘭地香氣成分中非常重要的芳香類化合物，具有典型水果的香氣[7]。

圖7 不同酵母菌株對芒果白蘭地芳香類化合物的影響Fig.7 Effect of different yeast strains on aromatic compounds in mango brandy

2.3 基于揮發(fā)性成分不同芒果白蘭地的主成分分析

為進一步從整體上呈現(xiàn)6種白蘭地揮發(fā)性物質(zhì)的差異，利用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分對應的最大特征向量的變量原則，然后一次剔除一個變量，利用剩余變量再進行主成分分析，經(jīng)過有限次的剔除之后，直至第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）所構成的信息量占總信息量的75%以上，相關矩陣的特征值見表2，揮發(fā)性風味物質(zhì)成分矩陣見表3。由表2可知，提取的第一、二主成分方差貢獻率累計達到78.097%，其中第一主成分構成的信息量占42.63%，第二主成分占35.47%。第一主成分和第二主成分對初始數(shù)據(jù)總方差的解釋率為78%，可以體現(xiàn)出不同的釀酒酵母釀造白蘭地的揮發(fā)性化合物成分信息。

表2 相關矩陣的特征值Table 2 Eigenvalues of the correlation matrix

表3 揮發(fā)性風味物質(zhì)成分矩陣Table 3 Matrix of volatile flavor substance composition

續(xù)表

6種不同酵母釀造的白蘭地樣品的主成分分析結果見圖8。由圖8可知，不同酵母釀制的白蘭地分布在不同的象限。P和E風味物質(zhì)組成相似性較高，對其影響較大的風味物質(zhì)有乙酸乙酯、乙醛、甲酸乙酯、丙醛等。R和A風味物質(zhì)組成具有一定的相似性，對其影響較大的物質(zhì)為乙酸、丙酸和硫酸，而M和C均獨立位于第一和三象限中，對C影響較大的物質(zhì)有蘋果酸、硫酸和甲酸乙酯等；M位于第一象限，苯乙酸乙酯、乳酸、棕櫚酸乙酯、甲醇、正丙醇等對M影響較大。其中第一主成分的代表指標為甲醇（0.982）、正丙醇（0.962）、棕櫚酸乙酯（0.879），特征值為5.541，方差貢獻率為42.629%，是最為重要的主成分，反映了在M型酵母中揮發(fā)性化合物里方差貢獻率最高。第二主成分的代表指標有丙醛（0.890）、乙酸乙酯（0.764）、乙醛（0.653），特征值為4.61，方差貢獻率為35.467%，主要反映了在P型酵母揮發(fā)性化合物里方差貢獻率最高。

圖8 基于揮發(fā)性風味成分的不同酵母菌株制備的白蘭地樣品主成分分析結果Fig.8 Principal component analysis results of volatile flavor components in brandy samples prepared by different yeast strains

3 結論

本研究對6種不同的釀酒酵母發(fā)酵蒸餾得到6種不同的芒果白蘭地，然后采用感官評價和氣相色譜分析法進行了分析檢測?？芍狢型酵母釀制的芒果白蘭地，香味濃郁且清香、口感甘冽，而其他酵母具有異味，口感不協(xié)調(diào)，酒體粗糙、粗劣等問題。通過氣相色譜分析法可知C型酵母產(chǎn)生的酸類物質(zhì)含量較高，M型酵母產(chǎn)生的醇類和醛酮類物質(zhì)含量較高，P型酵母產(chǎn)生的酯類物質(zhì)含量較高，R型酵母產(chǎn)生的芳香類物質(zhì)含量較高，A型酵母與E型酵母產(chǎn)生的各類揮發(fā)性化合物含量均不突出。

所以最終選定釀酒酵母C型酵母作為釀造芒果白蘭地的最佳菌種。進一步主成分分析得知，C型酵母釀制的白蘭地風味物質(zhì)組成明顯區(qū)別于其他組，對其影響較大的風味物質(zhì)主要是乙酸和甲酸乙酯。這對不同釀酒酵母的特點的研究以及其用于釀造優(yōu)質(zhì)的芒果白蘭地具有指導意義。