基于Illumina Hiseq高通量測序紅曲霉轉錄組學分析

岳倩倩，趙永霞，王先桂，周禮紅

（1.茅臺學院 實驗實訓教學中心，貴州 遵義 564507；2.遵義醫科大學 藥學院，貴州 遵義 563003；3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

紅曲霉（Monascus）作為一種藥食用絲狀真菌，其次級代謝產物包括天然紅曲色素、γ-氨基丁酸、莫納可林（Monacolin）K、桔霉素等[1-2]。紅曲色素作為一種聚酮類代謝產物，現已有110多種被發現[3]，根據其溶解性可分為醇溶性和水溶性2種[4]。紅曲色素具有食品著色劑的生物安全性和適用性[5]，已被用于研制具有功能特性的調味品[6]、酒類[7]、肉制品[8]和面制品[9]等。除此之外，紅曲色素具有羥基、醚鍵、羰基等官能團和共軛結構，具有抗突變[10]、抗癌[11]、抗肥胖[12-13]、抗氧化[14]、降血壓[15]和抗阿爾茲海默癥[4]等多種生物活性，使得紅曲色素在功能性食品、制藥等方面有更廣的應用前景。

氮源作為重要的能源物質，對真菌生長發育過程中大分子物質有調控作用，已有關于構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脈胞菌（Neurosporacrassa）中氮代謝調控機制的研究[16-17]。岳倩倩等[18]考察不同的無機氮源對紅曲霉菌絲生長和產色素的調控情況發現，銨態氮對紅曲霉生長和產色素有促進作用，亞硝態氮則有抑制作用，但其氮代謝調控機制尚不清楚。

隨著第二代測序技術的出現，組學技術應運而生。到目前為止，主要的組學方法包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等[19-20]。其中，轉錄組學因其具有靈敏度高、費用低、針對性強、對其篩出的遺傳標記可直接進行應用等優點而率先取得進步[21]。因其可以用于深度挖掘新基因、確定代謝途徑及進化分析[22-23]，已被廣泛應用于生物學、醫學、農學等領域。如稻曲病菌有性生殖中光誘導基因的轉錄組分析[24]、大青轉錄組測序及生物信息學分析[25]等。為深入研究氮源對紅曲霉生長和產色素的調控機制，本研究分別以銨態氮、亞硝態氮為氮源培養安卡紅曲霉（Monascus anka）菌株GZUM-25，采用Illumina二代測序平臺對紅曲霉GZUM-25進行轉錄組測序分析，分析不同氮源條件下調控紅曲霉菌絲生長和產色素的差異表達基因，并對基因進行GO功能富集及KEGG通路富集分析，以期為后續紅曲霉基因的深度挖掘提供信息資源和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

安卡紅曲霉（Monascus anka）GZUM-25：本實驗室分離保藏。

1.1.2 培養基

沙氏瓊脂改良培養基[25]：麥芽糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，瓊脂20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌25 min。液體培養基中不添加瓊脂。

察氏培養基[25]：NaNO33g/L，K2HPO41g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃高壓滅菌25 min。

調控培養基：向察氏培養基中分別添加1%的NaNO2、（NH4）2SO4兩種不同的無機氮源，用于紅曲霉菌株培養。

1.1.3 化學試劑

麥芽糖、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：奧博星生物技術有限公司；NaNO2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4（均為分析純）：重慶北碚精細化工廠；（NH4）2SO4（分析純）：重慶川江化工有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DH-360A電熱恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82A數顯氣浴恒溫振蕩器：金壇市晶玻實驗儀器廠；Trizol總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）抽提試劑盒、TruseqTMRNA sample prep試劑盒、Dynal M280磁珠：美國Invitrogen公司；NanoDrop2000：美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲霉樣品制備

將安卡紅曲霉菌株GZMU-25接種到沙氏瓊脂改良培養基上，30 ℃恒溫培養10 d。將已活化的安卡紅曲霉菌株GZMU-25用10 mL無菌水洗下后，將孢子懸液分別轉移到含1%NaNO2和1%（NH4）2SO4的調控培養基中，分別編號為MP1、MP2，30 ℃、230 r/min條件下振蕩培養7 d。培養結束后，將菌絲用無菌鑷子挑出，用液氮速凍保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 總RNA的提取

采用總RNA提取試劑盒提取經液氮冷凍保藏的菌絲球總RNA，通過NanoDrop2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent 2100測定RNA完整值（RNA integrity number，RIN），挑選滿足測序要求的RNA樣本進行轉錄組測序。

1.3.3 文庫的構建和Illummina Hiseq測序

利用帶有Oligo（dT）的磁珠與poly A進行腺嘌呤（adenine，A）-胸腺嘧啶（thymine，T）配對，從樣本MP1、MP2總RNA中分離出信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），加入fragmentation buffer，將mRNA隨機斷裂成堿基長度為200 bp左右的小片段。在逆轉錄酶的作用下，加入六堿基隨機引物，以mRNA為模板反轉錄合成第一鏈互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），隨后進行第二鏈合成，形成穩定的雙鏈結構。對雙鏈cDNA進行末端修飾、片段大小選擇，最后選擇富集合格的文庫進行Illummina Hiseq測序。

1.3.4 序列分析和功能注釋

通過Illummina Hiseq測序得到包含測序接頭序列、低質量讀段、N（無法確定堿基信息）率較高序列及長度過短序列的原始測序數據，采用軟件SeqPrep、Sickle對原始數據進行閱讀框（reads）中接頭序列的去除、3'端低質量堿基的修剪及含N比率＞10%reads的去除。利用bowtie將修剪后的測序數據比對到基因組上，檢測外顯子之間的可變剪切信息，并將最終得到的序列與Nr、GO、KEGG數據庫進行對比，并對其功能進行注釋。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉轉錄組測序與轉錄分析

對原始數據進行統計分析，結果見表1。由表1可知，從樣品MP1中得到的閱讀框（reads）總數和堿基總數分別為62 127 568條和9 381 262 768 bp；從樣品MP2中得到的reads總數和堿基總數分別為52 725 002條和7 961 475 302 bp。對原始數據進行質量修剪后，樣品MP1得到的Clean reads和Clean堿基總數分別為61 233 790條和9 145 916 108 bp；樣品MP2得到的Clean reads 和Clean 堿基總數分別為51 890 476條和7 746 137 365 bp。樣品MP1和MP2的鳥嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量分別為53.29%、53.10%，Q20堿基比例分別為98.59%、98.53%，Q30堿基比例分別為95.78%、95.64%。通過與參考基因組對比后，樣品MP1和MP2得到的Uniquely mapped總數分別為45 194 295、35 139 204，占比分別為73.81%、67.72%。結果表明，該轉錄組樣本測序質量較高，可進行下一步樣品中差異基因的分析。

表1 轉錄組測序結果統計Table 1 Statistics of transcriptome sequencing analysis results

2.2 紅曲霉樣本間差異基因的分析

使用edgeR軟件，根據gene read count數據進行差異表達計算，按照錯誤發現率（false discoveryrate，FDR）＜0.05且差異倍數（fold change，FC）對數值的絕對值（｜log2FC｜）≥1為標準，對樣品差異基因進行篩選，結果見圖1。

圖1 紅曲霉樣本間差異表達基因散點圖Fig.1 Scatter plot of differentially expressed genes between Monascus samples

由圖1可知，樣本MP1與MP2中共存在2 117個基因，其中存在顯著差異基因有95個，37個基因屬于顯著上調，58個基因屬于顯著下調。

2.3 紅曲霉樣本間差異表達基因的GO功能富集分析

使用Goatools軟件對紅曲霉樣品間差異表達的基因進行GO功能顯著性富集，利用GO數據庫，以P≤0.05為篩選標準，按照基因參與的生物學過程（biological process，BP）、構成細胞組分（cellular component，CC）、實現的分子功能（molecular function，MF）等將MP1、MP2樣品存在的差異表達基因進行比對分析，結果見圖2。由圖2可知，在樣本MP1和MP2中，差異基因參與了生物學過程、細胞組分和分子功能。將95個差異基因分別映射到46個代謝通路中，在分子功能中，主要富集通路為鐵離子連接（iron ion binding）和單氧化酶活性（monooxygenase activity），均有5個差異基因參與，均占差異表達基因總數的5.26%。其次是氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、血紅素結合（heme binding）等。在細胞組分中，主要富集通路為葡萄糖苷酶II復合物（glucosidase II complex）、細胞表面（cell surface），參與的差異表達基因數均為1個，均占總差異表達基因總數的1%。在生物學過程中，主要富集通路為葡萄糖代謝過程（sucrose metabolic process）、淀粉代謝過程（starch metabolic process）、細胞碳水化合物代謝過程（cellular carbohydrate metabolic process），參與差異表達的基因數分別有3個、3個、4個，占總差異表達基因總數的3.16%、3.16%、4.21%。

圖2 紅曲霉樣本間差異表達基因的GO功能富集結果Fig.2 GO functional enrichment results of differentially expressed genes between Monascus samples

2.4 紅曲霉樣本間差異表達基因的KEGG通路富集分析

以P≤0.05作為篩選差異基因在KEGG通路顯著富集的標準，使用軟件KOBAS對紅曲霉樣本間差異基因進行KEGG通路富集分析，結果見圖3。由圖3可知，在樣品MP1和MP2中，95個差異基因中有11個基因注釋到KEGG 17條通路中。包括磷酸肌醇代謝（inositol phosphate metabolism）、氨基苯基酸酯降解（aminobenzoate degradation）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氯代環己烷和氯苯降解（chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation）、緊密連接（tight junction）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（valine，leucine and isoleucine biosynthesis）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）等。在以上差異表達基因富集通路中，磷酸肌醇代謝（inositol phosphate metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、苯乙烯降解（styrenedegradation）以及氨基苯基酸酯降解（aminobenzoate degradation）差異基因參與數目最多，均為2個，可推測以上4條通路在紅曲霉菌絲生長和色素產生方面存在重要作用。

圖3 紅曲霉樣本間差異表達基因的KEGG通路富集分析結果Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis results of differentially expressed genes between Monascus samples

3 結論

以銨態氮、亞硝態氮為氮源培養安卡紅曲霉（Monascus anka）菌株GZUM-25，采用Illumina二代測序平臺對紅曲霉GZUM-25進行轉錄組測序分析發現，銨態氮和亞硝態氮培養下的安卡紅曲霉GZUM-25基因組中有95個差異表達基因，其中，上調基因有37個，下調基因有58個。通過GO功能富集及KEGG通路富集分析發現，差異基因主要富集的功能為生物學過程、細胞組分和分子功能，富集的通路為磷酸肌醇代謝、淀粉和蔗糖代謝、苯乙烯降解、氨基苯基酸酯降解。本研究為紅曲霉相關功能基因的挖掘提供了理論支持。