重組蛋白PFKFB3 的表達、純化及酶活測定

麥瑋倩 鄭慜成 周亞琪 劉志平 洪梅 許潔安

腫瘤細胞代謝的研究是近年腫瘤領域的研究熱點之一［1,2］。研究發現大部分的腫瘤促進因子或抑制因子直接影響腫瘤細胞代謝分子。其中糖酵解分子的表達、活性及調控對腫瘤的發生、發展、轉移、消退起著至關重要的作用［3,4］。在腫瘤細胞增殖過程中,糖酵解所涉及的分子,包括轉運分子、關鍵酶及限速酶,都成為新的抗腫瘤藥物靶點。相應的,以腫瘤細胞代謝為靶向的新藥研發也成為當今新型抗腫瘤藥物研發的主要方向之一。

6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶(PFKFB)分子是目前受明顯關注的影響腫瘤代謝的一組分子［5］。PFKFB 是控制果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)水平的家族性雙功能酶［6］。這類酶的N 端能在F-6-P與ATP 存在的條件下合成F-2,6-BP。相反的,PFKFB也能在果糖-2,6-二磷酸酶C 端作用下催化上述反應的逆反應,即F-2,6-BP 水解為F-6-P 和無機正磷酸鹽。在葡萄糖的代謝過程中,6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1)催化F-6-P 轉變成果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)是關鍵的限速步驟。而PFKFB 的產物F-2,6-BP是PFK-1 最強的激活劑。因此,抑制PFKFB 的表達或活性進而降低F-2,6-BP 水平,可顯著抑制PFK1 的活性,進而抑制細胞糖代謝,最終抑制細胞的增殖［7］。相應地,調節PFKFB 及F-2,6-BP 的水平可以抑制腫瘤的發生發展。

哺乳動物的PFKFB 有4 種異構體,其中PFKFB3是目前與腫瘤最相關的PFKFB 靶標［8,9］。PFKFB3 編碼的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性較其磷酸酶活性高700 余倍,而由PFKFB1、2、4 編碼的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高或兩者活性相當［6］。無論是實驗性的離體及在體腫瘤生長,都需要PFKFB3存在［10,11］。很多來自人的腫瘤標本中,與其相鄰近的正常細胞相比,腫瘤細胞中PFKFB3 的表達明顯增高,這些腫瘤包括膠質瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等［12］。

本研究在大腸桿菌中表達了PFKFB3 并通過Ni 柱親和層析和分子篩純化得到高質量的重組蛋白,并測定其酶活性質,為人PFKFB3 功能研究和抑制劑開發奠定基礎。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和試劑 原核表達載體pET-30b(+)、大腸桿菌(E.coli)DH5、E.coli BL21(DE3)菌株由本實驗室保存,限制性內切酶購于Takara 公司,質粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。氯化鈉(NaCl,S7653),氫氧化鉀(KOH,P5958),3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS,M1254),六水氯化鎂(MgCl2·6H2O,M2670),焦磷酸鈉(Na4P2O7,P8010),聚乙二醇6000(PEG6000,81255),聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100,T9284),二硫蘇糖醇(DTT,D9163),苯甲基磺酰氟(PMSF,P7626),甘油(V900122),F-6-P(F3627),ATP(A26209),磷酸丙糖的異構化酶(TIM,T6258),甘油-3-磷酸脫氫酶(GDH,G6880),醛縮酶(Aldolase,A8811),還原型輔酶Ⅰ(NADH,N8129),IPTG、溶菌酶、考馬斯亮藍R250、卡那霉素(Kan)購于Sigma 公司。乙二胺四乙酸(EDTA,15575-038)購于invitrogen 公司,β-巰基乙醇(0482)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,0497)購于AMRESCO 公司,牛血清白蛋白(BSA,126579)購于CALBIOCHEM 公司,胰蛋白胨(LP0042)、酵母浸出粉(LP0021)購于英國OXOID 公司,蛋白酶抑制劑(DI101-02)購于全式金公司,Bradford 蛋白質濃度測定試劑盒購于Bio-Rad 公司,其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 Luria-Bertani(LB)培養基 LB 培養基的配置：胰蛋白胨10 g/L,酵母浸出粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,加入1 L 雙純水溶解,高壓滅菌20 min。固體培養基是在上述培養基中加入2 g/L 的瓊脂。

1.1.3 PPi-PFK 參照Van 等［13］的報道,將土豆洗凈去皮,稱取100 g,加入300 ml 提取液(100 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,5%甘油,7 mmol/Lβ-巰基乙醇,1 mmol/L PMSF,1×蛋白酶抑制劑,pH 值8.4),研磨,8層紗布過濾,4℃,30000 r/min離心30 min,留上清得粗提液,依次加入5%、10%、5% PEG6000,每次加入后攪拌溶解,冰浴30 min,4℃,30000 r/min,離心30 min,取上清液。分裝于2 ml 離心管,4℃,14000 r/min,離心30 min,棄去上清,保留沉淀,此沉淀即為PPi-PFK。真空泵吸干離心管內的液體,-20℃保存。使用前用1 ml的提取液重懸溶解沉淀后,4℃,14000 r/min,離心20 min,取上清液,然后用考馬斯亮藍法法測量蛋白濃度。

1.2 方法

1.2.1 PFKFB3 表達載體的構建 以人PFKFB3 編碼序列為模板,使用生物信息學方法優化設計PFKFB3的原核編碼序列,增強其在原核生物中的表達效能。用合成方法獲得優化后的全長編碼序列,在其5'端及3'端分別插入NdeI 和XhoI 酶切位點,同時在5'端酶切位點加入6-His 表達標簽序列,用于后續的蛋白純化工作。在基因3'端添加終止密碼子TAA。隨后將該脫氧核糖核酸(DNA)片段經NdeI/XhoI 雙酶切后,插入pET-30b(+)載體,經E.coli DH5 轉化、篩選、擴增后獲得重組質粒,經測序分析后獲得陽性克隆pET-30b(+)-PFKFB3。

1.2.2 PFKFB3 的誘導表達 接種pET-30b(+)-PFKFB3 轉化的E.coli BL21(DE3)單克隆于含有50 ml LB 液體培養基的250 ml 三角瓶中于37℃,180 r/min振蕩培養過夜。次日將過夜培養物以1%的量接種于新的含有600 ml LB 液體培養基的2 L 三角瓶中,于37℃,180 r/min 培養至OD600 達到0.6～0.8,加入IPTG至終濃度25 μg/ml,于16℃,140 r/min 繼續培養16 h。8500 r/min,4℃離心15 min 收集菌體沉淀。沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2 次,每次洗后均以5000 r/min,4℃,離心30 min。1 g 菌體加入20 ml 裂解液(含200 μl PMSF,20 μl 蛋白酶抑制劑,8 μl β-巰基乙醇)。冰浴超聲破碎菌體,設置超聲波細胞破碎機為轉5 s,停5 s,功率60%,運行1 h,35 000 r/min 離心后分別收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白電泳,考馬斯亮藍R250 染色后觀察結果。

1.2.3 PFKFB3 重組蛋白的純化 先用含有10 mmol/L咪唑的PBS 10 ml 平衡Ni 柱,使之帶有電荷,再封住Ni 柱底端。加入5 ml 含10 mmol/L 咪唑的PBS 使Ni柱重懸,將此重懸液加入到蛋白溶液中,4℃緩慢旋轉30～60 min,使Ni 柱吸附His-PFKFB3 蛋白。然后倒入Ni 柱,使廢液流出。然后依次用含20、50 mmol/L 咪唑的PBS 100 ml 洗清Ni 柱,收集濾液置于冰上。再依次用含200、500 mmol/L 咪唑的PBS 5 ml 洗脫Ni 柱,此時洗脫下來的蛋白為PFKFB3 蛋白,將經過Ni 親和層析純化后的蛋白,進一步經過分子篩再次進行純化,純化后保存于含1 mmol/L DTT 的PBS 中,考馬斯亮藍法測量其蛋白濃度。

1.2.4 PFKFB3 酶活測定 PPi-PFK 酶活分析方法通過測定NADH 在340 nm 處的損耗量和反應速率,來反映PFKFB3 的酶活性。此分析方法分為兩步：第一步,F-6-P 和ATP 在PFKFB3 的作用下生成F-2,6-BP,反應液 組分如 下：50 μmol/L F-6-P,50 μmol/L ATP,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L DTT,2 nmol/L PFKFB3,MOPS-NaCl 緩沖液(40 mmol/L MOPS,150 mmol/L NaCl,100 μmol/L EDTA,0.01% Triton X-100,0.5 mg/ml BSA,pH 值7.5)補足到100 μl,在37℃下孵育60 min,10 μl 1 mol/L KOH 終止反應。第二步,測定NADH 的消耗量,其與第一步反應生成的F-2,6-BP 的量呈正相關,反應液組分如下：1 mmol/L F-6-P,0.7 U/ml Aldolase,0.45 U/ml GDH,0.6 U/ml TIM,2 mmol/L MgCl2,5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L NADH,5 μg PPi-PFK,Tris-HCl 緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 值7.5)補足到150 μl,再加入2 μl 第一步反應液,最后加入3 μl 25 mmol/L Na4P2O7啟動反應,并立即在酶標儀檢測NADH 消耗速率。反應溫度為37℃,測定間隔為30 s,檢測波長為340 nm,運行時間為30 min,測得平均反應速度(Mean V)數值,用GraphPad Prism 軟件計算PFKFB3 的Km 值。

2 結果

2.1 人PFKFB3 原核表達載體的構建 通過基因全合成的方法,得到了優化后的編碼人PFKFB3 基因的全長DNA。隨后,將該DNA 產物經NdeI 和XhoI 雙酶切處理,連接至同樣經過雙酶切處理的載體質粒,經E.coli DH5 轉化、篩選、擴增后,最終獲得了用于原核表達的pET30b(+)-PFKFB3 質粒,經測序顯示該質粒正確。

2.2 人PFKFB3 重組蛋白的誘導表達 誘導原核表達載體pET30b(+)-PFKFB3轉化的E.coli BL21(DE3) 菌株。收集大量表達pET30b(+)-PFKFB3 的菌體,使用超聲的方法破碎菌體。細菌裂解液沉淀經SDS-PAGE 電泳分析,裂解菌液沉淀在55～70 ku 處無明顯的重組蛋白條帶。見圖1 泳道1。上清液經過Ni 親和柱后,用含有20、50 mmol/L 咪唑的PBS 清洗液分別清洗柱子,SDS-PAGE 電泳檢測表明20、50 mmol/L 咪唑的PBS清洗液可以去除大部分雜蛋白。見圖1 泳道2～6。最后,用含有200、500 mmol/L 咪唑的PBS 洗脫液分別洗脫,SDS-PAGE 電泳檢測表明200、500 mmol/L 咪唑的PBS洗脫液可以得到粗純化后的重組蛋白PFKFB3。見圖1泳道7～9。同時重組蛋白PFKFB3 的分子量理論值為58 ku,表明重組蛋白PFKFB3 可以以較高的純度誘導表達。

2.3 人PFKFB3 重組蛋白的分離純化 考慮到在35 ku 和80 ku 處仍有比較明顯的蛋白雜帶(圖1 泳道7～9),因此,進一步通過分子篩對蛋白PFKFB3 進行純化。蛋白豐度圖譜結果表明,經分子篩純化后,雜蛋白在PFKFB3 蛋白液中所占比例明顯減少,提高了重組蛋白PFKFB3 的純度。見圖2。經過蛋白濃度測定,每升培養基可獲得10～20 mg PFKFB3 重組蛋白。

圖1 PFKFB3 經Ni 柱親和層析純化后的SDS-PAGE 電泳圖

圖2 PFKFB3 蛋白純化后的蛋白豐度圖譜

2.4 人PFKFB3 重組蛋白的酶活測定 PFKFB3 的酶活分析采用PPi-PFK 分析方法,其中PPi-PFK 即糖酵解的第二個限速酶PFK1,該酶提取于剛發芽的土豆,可在-20℃保存1 周,提取物為淡黃色(見圖3 中2 號管),如果變成棕色,則PPi-PFK 酶活降低,需要重新制備(見圖3 中1 號管)。

圖3 PPi-PFK 的性狀

PPi-PFK 分析方法通過測定NADH 在340 nm 處的損耗量和反應速率來反映經PFKFB3 產生的F-2,6-BP的多少,經PFKFB3 產生的F-2,6-BP 越多,NADH 的損耗量和反應速率越大。1～6 nmol/L PFKFB3 的第一步反應液梯度稀釋與NADH 的平均反應速率顯示出良好的線性關系。該結果提示,在此條件下,可以進行PFKFB3 酶活研究和PFKFB3 抑制劑篩選。見圖4。

圖4 PFKFB3 重組蛋白的酶活測定

Km 值是酶活研究中一個極為重要的數據,是酶促反應速度為最大速度1/2 時的底物濃度。PFKFB3 的底物有兩個,即F-6-P 和ATP。為了測定其Km 值,以7 種濃度梯度的F-6-P 或ATP 作為底物,加入相同的PFKFB3 重組酶進行酶促反應。以底物濃度的倒數1/S為橫坐標,以NADH 消耗速率的倒數1/V 為縱坐標,得到雙倒數曲線如圖5 所示,經米氏方程計算得出,PFKFB3 底物F-6-P 的Km 值為142.5 μmol/L。見圖5a。PFKFB3 底物ATP 的Km 值為34.21 μmol/L。見圖5b。

圖5 PFKFB3 重組蛋白的F-6-P 和ATP 的Km 值測定

3 討論

本研究構建了PFKFB3 的原核表達載體,通過大腸桿菌表達后,提取純化PFKFB3 蛋白并對其酶性質進行了測定。首先,在感受態細胞BL21(DE3)中轉入PFKFB3 原核質粒,經終濃度為25 μg/ml 的IPTG 誘導,在16℃培養細菌過夜,表達PFKFB3 重組蛋白。冰上超聲破菌,離心收集蛋白,SDS-PAGE 電泳結果顯示,重組蛋白PFKFB3 主要存在于上清中。通過Ni 柱親和層析和分子篩純化蛋白,蛋白豐度圖譜結果顯示,PFKFB3 蛋白經過Ni 柱親和層析和分子篩純化后,基本只有一個PFKFB3 的強吸收峰,純化效果良好。應用考馬斯亮藍法測定PFKFB3 蛋白濃度為2～3 μg/μl,成功獲得了較高純度和濃度的PFKFB3 重組蛋白。進一步的PFKFB3 酶活研究表明,在50 μmol/L F-6-P 的條件下,測出PFKFB3 對ATP 的Km 值為34.21 μmol/L。在50 μmol/L ATP 的條件下,測出PFKFB3 對F-6-P 的Km 值為142.5 μmol/L。

PFKFB3 已在腫瘤細胞中進行了廣泛的研究,最近幾年,PFKFB3 的功能研究已經延伸到血管細胞和免疫細胞,與血管生成、肺動脈高壓和膿毒血癥等疾病密切相關［14-17］。另外,在抑制劑方面,小分子PFKFB3抑制劑3PO 被廣泛應用,但研究表明,3PO 與PFKFB3無法形成共結晶,提示3PO 不通過PFKFB3 來降低細胞糖酵解［18］。而最新的PFKFB3 抑制劑AZ 系列,如AZ26,其細胞半抑制濃度(IC50)低至0.281 μmol/L,但AZ26 在整體動物中的安全性評估還未見報道［18］。因此,重組蛋白PFKFB3 的成功獲得,可以為PFKFB3 結構和功能的進一步研究及抑制劑的篩選提供材料并奠定基礎。