基于Sirt1 通路探討栝樓桂枝湯對缺血性卒中后神經元損傷的保護作用

楊勁博 鐘興華 林心君 胡海霞 朱曉勤

腦卒中中醫名為中風,是一種常見的腦血管疾病,分為缺血性卒中和出血性卒中,缺血性卒中占80%,嚴重危害患者的健康和生命［1］,缺血性卒中涉及到血腦屏障功能障礙、炎癥反應、氧化應激等多種機制,最終導致不可逆的腦組織損傷［2,3］,同時肢體痙攣［4］是最主要的后遺癥。腦缺血后機體內產生的氧化應激是導致腦組織損傷的主要因素。氧化應激是自由基生成過多與抗氧化機制消除之間的一種不平衡狀態［5,6］。缺血再灌注發生后,神經系統中活性氧(ROS)生成過多,通過蛋白質、脂質和DNA 的氧化修飾［7,8］,破壞血腦屏障的完整性,激活炎癥細胞和促進白細胞浸潤來增強炎癥反應,導致自噬、凋亡引起卒中后繼發性腦損傷［9,10］。GLGZD 源于《金匱要略》,功效為解肌祛邪,舒緩筋脈,主治太陽柔痙體強證,用于治療腦卒中后肢體痙攣［11］,在基礎研究和臨床研究中均表現出對腦卒中的保護作用［12,13］,本研究基于中藥多靶點調控卒中后的氧化還原穩態,探討GLGZD 通過Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路抑制凋亡進而減輕神經元損傷的作用機制,為臨床用藥提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠60 只,體質量(180±20)g,購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司,生產許可證號：SCXK(瀘)2017-0005,飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心,使用許可證號：SYXK(閩)2019-0007。本研究已通過福建中醫藥大學動物倫理委員會審核,并嚴格遵循動物倫理相關規定。

1.1.2 藥物 GLGZD 組方：栝樓根30 g、桂枝9 g、生姜9 g、白芍9 g、大棗9 g、甘草6 g。均購自福建中醫藥大學第三附屬醫院國醫堂。上述藥材煎煮2 次并濃縮至1.06 g/ml。灌胃時根據人與大鼠臨床等效劑量換算。

1.1.3 試劑 GAPDH 抗體(Bioss 公司,貨號：bsm-0978M)；Sirt1 抗體(SantaCruz 公司,貨號：sc-74465)；PGC-1α 抗體(abcam 公司,貨號：ab191838)；ERRα抗體(CST 公司,貨號：#13826)。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司,型號分別為：DM400B LED、DMi8)。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動脈阻塞模型制備 戊巴比妥鈉(2%)腹腔注射麻醉大鼠并固定于鼠板上,于頸正中剪一切口,分離頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈,結扎頸總動脈、頸外動脈,用眼科剪在頸總動脈近心端血管壁剪一小口,將線栓從頸總動脈插入頸內動脈,線栓進入的深度約為18 mm,阻斷血流供應1.5 h,后將線栓部分退出,恢復血流供應。待大鼠從麻醉中蘇醒,參照改良神經功能缺損Longa 評分對大鼠神經功能損傷程度進行評價,評分為1～3 分者視為造模成功,納入實驗。

1.2.2 分組與給藥 將造模成功的40 只大鼠隨機分為MCAO 組與GLGZD 組,每組20 只；另外20 只設Sham 組,僅鈍性分離肌肉血管,不插入線栓。三組大鼠均在手術當天評分并于分組后開始灌胃干預,Sham組和MCAO 組給予0.9%生理鹽水灌胃,GLGZD 組給予GLGZD 水提液灌胃,1 次/d,連續7 d。

1.2.3 Longa 評分評估神經功能缺損 分別于造模結束后及藥物干預7 d 后,采用Longa 評分進行神經行為學評定［14］。

1.2.4 模型大鼠血清中MDA、GSH-Px 的含量測定取大鼠血清,按照MDA 測試盒說明書和GSH-Px 測試盒說明書,檢測各組大鼠血清中MAD、GSH-Px 含量。

1.2.5 qPCR 法檢測Sirt1、PGC-1α、ERRα mRNA的表達水平 Trizol 法提取大鼠腦組織總mRNA,參照試劑盒方法逆轉錄和qPCR 反應。引物序列見表1。以GAPDH 作為內參,使用2-ΔΔCt計算目標mRNA 的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot 法檢測Sirt1、PGC-1α、ERRα蛋白的表達水平 取腦組織稱重并置于研磨儀,裂解后,進行BCA 蛋白定量、金屬水浴變性,-20℃保存。通過SDS-PAGE 凝膠電泳及轉模,以GAPDH 為內參,對Sirt1(1∶500,132 kDa)、PGC-1α(1∶1000,91 kDa)、ERRα(1∶1000,50 kDa)、GAPDH(1∶5000,36 kDa)蛋白進行半定量分析。

1.2.7 TUNEL 法檢測缺血側腦組織神經細胞的凋亡率 石蠟切片脫蠟復水固定后,滴加蛋白酶K 室溫孵育30 min,平衡緩沖液室溫孵育10 min,滴加50 μl rTdT緩沖液,37℃避光孵育1 h,滴加2 × SSC 溶液避光孵育15 min,DAPI 染核8 min,抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光倒置顯微鏡200 倍鏡下觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,符合正態分布的數據采用單因素方差分析,方差齊性的數據采用最小顯著差法檢驗,方差不齊的數據則采用蓋姆斯-霍威爾法。不符合正態分布的數據采用非參數檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GLGZD 對模型大鼠Longa 評分的影響 干預后,MCAO 組與GLGZD 組Longa 評分均高于Sham 組,差異有統計學意義(P＜0.01)；GLGZD 組Longa 評分低于MCAO 組,差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖A。

圖A 大鼠Longa 評分

2.2 GLGZD 對模型MDA、GSH-Px 含量的影響 干預后,MCAO 組MDA 水平高于Sham 組、GSH-Px 水平低于Sham 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)；GLGZD組MDA 水平低于MCAO 組、GSH-Px 水平高于MCAO組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖B。

圖B 大鼠血清MDA、GSH-Px 的表達

2.3 GLGZD 對模型大鼠缺血側腦組織Sirt1、PGC-1a、ERRa 的mRNA 和蛋白表達水平的影響 qPCR與Western blot 實驗結果顯示,干預后,MCAO 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表達水平低于Sham 組,差異有統計學意義(P＜0.05)；GLGZD 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表達水平均高于MCAO 組,ERRα 的mRNA 及蛋白表達水平低于Sham 組,差異有統計學意義(P＜0.05)；見圖C。

圖C 大鼠Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路基因和蛋白的表達

2.4 GLGZD 對模型大鼠缺血側腦組織神經細胞凋亡率的影響 TUNEL 染色顯示,干預后,Sham 組大鼠少見TUNEL 陽性細胞,神經細胞凋亡較少；MCAO 組大鼠缺血側腦組織神經細胞凋亡率高于Sham 組,差異有統計學意義(P＜0.05)；GLGZD 組缺血側腦組織神經細胞凋亡率低于MCAO 組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖D。

圖D 大鼠神經細胞凋亡率(TUNEL 染色200×)

3 討論

缺血性卒中是一種具有復雜特性的腦部疾病,涉及到多種病理生理過程。MCAO 模型是目前國際上認可和通用的缺血性卒中模型。本研究發現,經GLGZD干預后,卒中后神經功能缺損明顯減輕。

氧化應激是導致缺血性腦卒中后神經功能損傷的重要病理環節。MDA 是氧化應激的標志物之一,最能反映組織氧化損傷的程度。GSH-Px 參與清除過多的ROS,在保護細胞免受氧化損傷中起著關鍵作用。降低MDA 含量、增加GSH-Px 活化,有利于減輕氧化應激損傷,起到神經保護作用［15,16］。本實驗結果顯示,GLGZD 干預后,MDA 含量明顯減少,GSH-Px 含量明顯升高,說明GLGZD 通過減輕氧化應激損傷起到保護作用。

Sirtuins(Sirts1-7)［17］是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的組蛋白脫乙酰酶家族,主要通過蛋白質的去乙酰化、多聚磷酸核糖基化等機制參與蛋白質的翻譯后修飾［18］。Sirt1 與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ 輔活化因子-1α(PGC-1α)相互作用［19］并直接去乙酰化,提高其轉錄活性,去乙酰化PGC-1α更有效地招募ERRα 等轉錄因子［20］,減輕ROS 生成所致的代謝障礙,減少氧化損傷維持細胞穩態,保護神經元免受凋亡。本實驗結果顯示,MCAO 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 表達水平較Sham 組顯著降低,GLGZD 干預后,上述情況出現逆轉,提示GLGZD 可通過調控Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路起到神經保護作用。

氧化應激通過多種途徑誘導細胞凋亡。DNA 片段化是凋亡標志之一。通過TUNEL 檢測DNA 片段化,簡單、快速地檢測大鼠腦組織中的凋亡細胞。本研究發現GLGZD 干預后,可顯著減少大鼠缺血側TUNEL 陽性細胞比例,降低神經細胞凋亡率,發揮神經保護作用。

綜上所述,GLGZD 可顯著改善大鼠神經功能缺損,通過調控Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路降低氧化應激損傷,減輕神經元凋亡,對腦缺血再灌注損傷具有較好的保護作用,這也為本實驗進一步研究GLGZD 的作用機制提供了實驗依據。本實驗不足之處在于,僅探討Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路對氧化應激的調控作用,其復雜的調控過程與關系有待進一步探索,故藥物多通路的調控作用可作為未來深入研究的重點方向。