重瓣萱草AGAMOUS基因的克隆與表達分析

張志國， 丁寒雪， 蔣成娣， 張世杰， 王藝程， 秦巧平， 劉 翔

(1.上海應用技術大學生態技術與工程學院，上海 201400； 2.金華花卉苗木產業研究院，浙江金華 321000)

花發育的ABC模型是一種成花模型，描述了在花的不同部位，不同轉錄因子對花器官形成的作用。其中C類基因主要控制心皮、雄蕊的發育，AGAMOUS(AG)是擬南芥(Arabidopsisthaliana)中唯一的C類基因，也是第一個被分離的MADS-box基因[1]。迄今，人們已經從不同植物中克隆并鑒定了很多AG同源基因，盡管這些基因在序列上存在些許差異，但功能是基本保守的[2]。AG基因的主要功能包括以下幾個方面：抑制A功能基因在第3輪、第4輪中的異常表達；在前期調控雄蕊、心皮和胚珠的正常發育；在后期控制細胞分化，終止花分生組織的分化以保證花器官的特征和數量[3]。1990年Yanofsky等通過T-DNA插入突變技術，獲得了AG基因突變的重瓣表型擬南芥(圖1)，其6枚雄蕊被6枚花瓣取代，與4枚正常的花瓣形成了具有10枚花瓣的突變體，而心皮也被4枚萼片和10枚花瓣取代，具有花中花的整體表型[1]；同年，Carpenter等通過轉座子誘變試驗，獲得了10種花器官同源異型突變的金魚草(Antirrhinummajus)，其中pleniflora-624、pleniflora-625和pleniflora-626的表型非常相似，第1輪、第2輪花器官表型與野生型相同，第3輪花器官變為花瓣狀結構，且與第2輪花瓣結合在一起，第4輪花器官由2個部分組成，在野生型金魚草心皮相對應的位置產生加厚卷曲表面蠟質的花瓣狀結構，且在第4輪內有5個瓣狀結構輪生[4]。1991年Coen等總結了花器官特異基因在植物4輪結構中的表達情況，并提出花發育的ABC模型，為植物花發育生物學的研究帶來了里程碑式的突破[5]。之后，隨著D類基因[6]及E類基因[7]的發現，花發育ABC模型不斷得到補充完善。

萱草(Hemerocallisfulva)是阿?；?Asphodelaceae)萱草屬(Hemerocallis)多年生草本植物，花被片數量通常為6枚，排成2輪，外輪花被片即萼片，未開放時在花蕾外起到保護作用，顏色通常較淺，內輪花被片較外輪花被片稍大，花色鮮艷，雄蕊通常與花被片同數，子房上位常3室，即萱草共有4輪花器官，由外向內數，第1輪為花萼，第2輪為花瓣，第3輪為雄蕊，第4輪為心皮[8]。我國是萱草屬植物的自然分布中心，已有3 000多年的種植歷史，世界萱草育種歷經1個世紀的發展，如今已經取得了卓越成就，但是目前應用于園林景觀的僅有少數幾個單瓣品種，因此萱草花型的補充改造是其育種的重要研究目標之一。隨著花卉基因工程研究的深入開展，人們相繼從萱草中分離了生物鐘相關基因HcLHY[9]與成花相關基因HkTFL1、HkSVP、HkAP1[10]、糖轉運蛋白相關基因HfSWEET2a[11]、衰老相關HhNAC1基因[12]等，但是對于花發育中極其重要的AGAMOUS基因在萱草中的研究尚未見報道。萱草1輪3枚花被片共2輪的單瓣表型為人們所熟知，然而隨著育種工程的發展，也產生了一些重瓣表型，產生重瓣表型的原因是否與AGAMOUS突變有關仍不得而知。筆者所在課題組在轉錄組測序和基因組測序數據的基礎上，從單瓣萱草品種秋紅、重瓣材料AH6中對C類同源基因HfAG進行克隆、多序列對比分析、理化性質分析、系統進化分析和生物信息學分析，為進一步探究萱草花器官形成過程中上述基因發揮的功能提供理論基礎，從而為萱草花型變異機制的研究和通過基因工程手段開展萱草重瓣育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料采自上海應用技術大學國家萱草種質資源庫(地理位置：121°5′E、30°8′N)，單瓣品種名稱為秋紅(圖2)，重瓣材料田間編號為AH6(圖3)，于2021年7—8月盛花期采集其未開放的花蕾(直徑在0.5～0.8 cm之間)，分離得到花萼、花瓣、雄蕊和心皮以及四者的混合樣，共10份樣品，于液氮中速凍后于-80 ℃保存，用于后續RNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第1條鏈的合成 分別以萱草秋紅、AH6的花蕾混合樣為材料，用RNApre Pure Plant Kit(Polysacchairdes & Polyphenolics)試劑盒提取總RNA，用NanoDrop One超微量紫外分光光度計檢測RNA的純度、濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，再以總RNA為模板，用M-MLV轉錄酶[購自寶生物工程(大連)有限公司]，以Oligo(dT)為引物，反轉錄合成cDNA第1鏈，將獲得的cDNA于-20 ℃保存。

1.2.2HfAG基因的克隆 參考筆者所在課題組前期建立的萱草秋紅全長轉錄組庫，篩選AG的同源基因序列，設計引物(表1)。以cDNA為模板，使用TaqDNA聚合酶[購自寶生物工程(大連)有限公司]進行PCR擴增。20 μL PCR擴增體系：2 μL 10×TaqBuffer with KCl，1.6 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，0.4 μL dNTP(10 mmol/L)，1 μL Primer-F(10 μmol/L)，1 μL Primer-R(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，12.8 μL ddH2O。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

1.2.3 目的基因的回收連接轉化與測序 將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，對檢測結果合格的PCR產物進行電泳分離，隨后用DNA凝膠回收試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)進行回收。將PCR純化產物連接到pMD19-T載體[寶生物工程(大連)有限公司]上，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行菌液PCR檢測，隨后對陽性菌落進行基因測序。

1.2.4 實時熒光定量PCR 以萱草材料秋紅、AH6同一花蕾的不同器官(萼片、花瓣、雄蕊、心皮)為材料提取的RNA為模板，用Vazyme公司的逆轉錄試劑盒(HiScript? Ⅲ RT Su perMix for qPCR)合成cDNA第1鏈。根據cDNA序列設計上、下游定量引物，HfAG基因和內參基因的引物序列見表1，其中內參基因是萱草最優內參基因HfGAPDH[13]，每個樣品設置3個重復，使用熒光定量試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)進行熒光定量PCR。設置3個生物學重復和3次技術重復，用2-ΔΔCT法[14]對基因進行相對定量分析。反應體系：10 μL SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、2 μL cDNA模板，用dd H2O補至 20 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環，熔解曲線為95 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 ahHfAG蛋白PCR與定量PCR的引物序列

1.2.5 生物信息學分析 用DNAMAN軟件分析陽性菌落的測序結果，用Primer Premier 5.0軟件將核苷酸序列蛋白質編碼區翻譯成氨基酸序列，對蛋白進行理化性質、保守結構域、親水性疏水性、二級結構、亞細胞定位等方面的預測和分析。基于MEGA version 7，采用鄰接法構建蛋白的系統發育進化樹，分析與其他物種的親緣關系。具體分析內容和工具見表2。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與序列分析

本研究以HfAG1084cF/cR為引物，分別以萱草秋紅、AH6的花蕾混合樣為材料提取RNA，反轉錄得到cDNA為模板進行PCR擴增。PCR產物經凝膠電泳檢測，在700 bp附近出現1條特異條帶(圖4)，與預測片段大小吻合，片段在回收后的測序結果表明，最終得到2個MADS-box基因的CDS序列。

表2 生物信息學分析網站及軟件

測序結果表明，ahHfAG的序列長度為624 bp。對序列進行多序列對比和結構域分析，結果(圖5)表明，ahHfAG具有典型的植物MADS-box基因結構，編碼肽鏈具有2個保守結構域，即MADS區(2～73 aa)、K區(88～172 aa)。MADS區、K區屬于MIKCc型基因特征基序[15]，MADS區、K區之間為長度為14個氨基酸的Ⅰ區，在二聚體的選擇性形成過程中起著關鍵作用[16]，而C端區域是位于K區下游保守性最低的轉錄激活區區間。雖然C末端的變化較大，但是MADS-box蛋白常含有一些保守基序，AGAMOUS基因有AG基序Ⅰ、Ⅱ這2個相對保守區[2，17]，高志紅等認為，這2個相對保守區是AG同源基因的特征之一[17-18]。

通過ProtParam軟件對萱草AG編碼氨基酸序列的理化性質進行預測，得到qhHfAG、ahHfAG編碼蛋白質的分子式、理論分子質量、等電點、總平均疏水性和不穩定性指數等。ahHfAG編碼蛋白質的總平均疏水性為-0.843，屬于親水蛋白，不穩定性指數為45.84，為不穩定蛋白；qhHfAG編碼蛋白質的總平均疏水性為-0.855，也屬于親水蛋白，不穩定性指數為46.25，為不穩定蛋白(表3)。兩者的疏水性和不穩定性略有差異。亞細胞定位預測結果顯示，萱草ahHfAG和qhHfAG編碼的蛋白定位于細胞核中，可知該蛋白合成后不需要分泌到細胞外，而是進入細胞核中。

表3 qhHfAG和ahHfAG編碼蛋白質的一級結構分析

2.2 同源性對比分析

將AG同源蛋白ahHfAG的氨基酸序列與美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中已知的序列進行比較分析。結果顯示，ahHfAG蛋白與玉簪(Hostaplantaginea)的HopAG(ACB70410.1)、蓮(Nelumbonucifera)的NenAGL(XP_010272685.1)、麝香百合(Liliumlongiflorum)的LMADS10(AIJ29174.1)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)的PeAGL(XP_020582512.1)等有較高的一致性，都在80%以上，其中與玉簪的HopAG(ACB70410.1)蛋白一致性最高，達88.78%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AG(AT4G18960)一致性為59.13%。

將重瓣萱草AG同源基因ahHfAG和單瓣萱草AG同源基因qhHfAG相比，發現有2個位點發生突變。一是第247位堿基，其突變導致位于保守性較低的Ⅰ區的第83位氨基酸產生變化，在單瓣品種秋紅中為絲氨酸(Ser)，而在重瓣萱草AH6中為蘇氨酸(Thr)。另一個是第296位堿基，其突變導致位于半保守的K區的第99位氨基酸發生變化，在單瓣品種秋紅中為丙氨酸(Ala)，而在重瓣萱草AH6中為纈氨酸(Val)。

圖6是ahHfAG與qhHfAG編碼的蛋白質和一致性靠前的4個不同物種蛋白質序列的BLAST比較分析結果?？梢钥闯觯被嵝蛄?′端的保守性比較高，而3′端的保守性比較低。且ahHfAG與qhHfAG缺少C末端AG基序Ⅱ這個相對保守區。

2.3 系統進化分析

在NCBI中用ahHfAG蛋白進行BLASTp比對，選取不同物種中已經確認的C功能MADS-box蛋白的氨基酸序列(序列信息見表4)構建系統進化樹(圖7)?？梢钥闯?，AmFAR、TAG1、HmAG、PgAG2、GhMADS10和AG歸為1支，屬于euAG同源蛋白；FBP6、LAG、SHP1、SHP2和PLE歸為1支，同屬于PLE同源蛋白；而ahHfAG基因的蛋白序列則與其他序列一同被歸于AG同源蛋白，即萱草的ahHfAG基因屬于AG譜系。此外，萱草與天門冬目的植物聚于1支，且與掃帚蘆筍(Asparagusvirgatus)的親緣關系最近，這也與同源性對比結果一致。

2.4 ahHfAG和qhHfAG基因的蛋白二級結構預測

用SOPMA在線分析工具對ahHfAG和qhHfAG編碼蛋白序列的二級結構進行分析。由表5可以看出，HfAG蛋白以α-螺旋結構為主，其次為無規則卷曲結構，延伸鏈占比較少，占比最少的是β-轉角，其中α-螺旋結構主要集中在K區。

表4 部分被子植物C類MADS-box蛋白

相較于qhHfAG基因，ahHfAG基因編碼蛋白在M區的第10位由α-螺旋變為β-轉角，在M區的第56位由延伸鏈變為α-螺旋；ahHfAG基因編碼蛋白在K區的第140～141位由無規則卷曲、延伸鏈變為α-螺旋；保守性最低轉錄激活區(C區)的第174～178位由α-螺旋變為無規則卷曲結構，第184位由α-螺旋變為無規則卷曲，第194～197位由α-螺旋變為無規則卷曲，第201～203位由無規則卷曲變為α-螺旋。

2.5 ahHfAG和qhHfAG編碼氨基酸的疏水性分析

使用在線工具ProtScale對qhHfAG編碼的氨基酸進行疏水性分析，結果表明，該肽鏈第45位點上的L疏水性最強，分值為2.089，而第71位點上的K親水性最強，分值為-2.556，預測qhHfAG編碼的氨基酸疏/親水性值總和為-170.621，因此認為該蛋白是親水性蛋白。而ahHfAG編碼氨基酸的疏水性最高值、最低值都沒有變化，但從第80～88位、第96～104位開始疏水性明顯升高，總和變為-168.12(圖9)。

2.6 ahHfAG編碼蛋白的表達分析

為了研究AG編碼蛋白的表達模式，以單瓣品種萱草秋紅、重瓣萱草AH6的同一花蕾不同花器官的cDNA為模板，以HfGAPDH為內參基因，用qRT-PCR技術對ahHfAG編碼蛋白在萱草不同器官中的表達量進行分析。由圖10 qRT-PCR結果表明，ahHfAG蛋白在萱草的雄蕊、心皮中均有較高的表達量，在花萼、花瓣中的表達量較低，推測該基因可能為特異性表達基因。其次，在單瓣品種秋紅中，qhHfAG蛋白在4輪花器官中均有表達，且在第1輪花萼中表達明顯，但是在重瓣萱草AH6中，表達范圍顯著收縮，在1、2輪花器官中幾乎不表達。這種表達模式與ABC模型中C類基因的表達模式較為符合。上述結果表明，HfAG基因在萱草花器官發育過程中發揮著重要作用，且在不同植物中功能較為保守。

3 討論與結論

本研究以萱草單瓣品種秋紅、重瓣材料AH6為試驗材料，用RT-PCR技術克隆了C類基因AGAMOUS的全長序列，用生物信息學軟件分析其序列信息，通過實時熒光定量PCR技術分析表達模式。結果表明，AGAMOUS基因作為C類功能基因可調控雄蕊、心皮和胚珠的正常發育，在植物花器官中均有表達，但在不同器官中的表達量存在差異。研究重瓣花的馴化過程可以發現，C類基因的功能喪失和表達收縮都會引起生殖器官的缺失，促進額外花瓣的形成，形成重瓣花。Dubois等通過研究1個由重瓣變為單瓣的月季(Rosahybrida)突變體發現，重瓣月季的形成與C類基因RhAG表達范圍縮小有關[19]。在重瓣品種中，RhAG的表達僅限于花芽的中心部位；而在單瓣突變體中，RhAG的表達范圍更大。從qRT-PCR結果可以看出，在單瓣品種秋紅中，qhHfAG蛋白在4輪花器官中均有表達，且在第1輪花萼中表達明顯，但是在重瓣材料AH6中，表達范圍顯著收縮，在1、2輪花器官中幾乎不表達。該研究結果與AGAMOUS基因在其他植物中的研究結果相似。

表5 萱草AG同源基因的二級結構預測分析結果

AGAMOUS基因具有典型的植物MADS-box基因結構，即MADS區(M區)、間隔區(I區)、角蛋白類似區(K區)和C末端區(C區)[20]。MADS區(第1～72位)含有C-A/T rich-GC(CArG)基序，是AG與其他DNA結合所必需的結合基元[21]，也是MADS-box基因中最保守的區域[22]。半保守的K區(第88～172位)是由疏水的氨基酸殘基規律性的間隔排列組成的coiled-coil結構，能夠折疊形成3個連續的兩性α-螺旋K1、K2、K3，參與有選擇性地介導蛋白與蛋白之間的相互作用[20]。在本研究獲得的萱草HfAG中，具有MADS區、K區這2個保守結構域，可以推測HfAG基因也是通過與其他基因結合來共同調控花器官發育的。Galimba等下調唐松草(Thalictrumthalictroides)栽培品種雙白的AG同源基因ThtAG1的表達，導致轉錄組無意義衰退和選擇性拼接，最終致使其蛋白的K區丟失，形成重瓣花[23]。在星花木蘭(Magnoliatomentosa)中，MastAG基因發生選擇性拼接，形成2種非正常的轉錄蛋白mastag-2蛋白(I區、K區缺失)和msatag-3蛋白(K區和C區缺失)，導致星花木蘭的花瓣數增加[24]。但是本研究發現，ahHfAG編碼蛋白具有較為完整的MADS-box基因結構，因此材料AH6重瓣的原因不是保守結構域的丟失。C區是位于K區下游的轉錄激活區區間[2]，AG基因編碼產物結合形成同源二聚體，或者與其他MADS家族基因編碼的蛋白質結合形成異源二聚體，然后特異地結合到靶基因DNA調控區，通過C末端與其他二聚體結合形成四聚體，再綁定到靶基因上游，調控下游靶基因的表達，指導花器官的形成。Mizukami等通過異位表達試驗表明，C末端對AG轉錄因子功能的正常發揮具有重要影響[25]。C末端保守性最低，但是常含有AG基序Ⅰ、Ⅱ這2個相對保守區。Liu等從單瓣和日本晚櫻(Prunuslannesiana)的栽培變種Alborosea中各分離出來1個AG基因的異構體[26]，重瓣品種的Prseag-1與單瓣品種的PrseAG相比有1個 170 bp 的外顯子跳躍且表達范圍更廣泛。Prseag-1可能因為C末端的AG基序Ⅰ、Ⅱ丟失而喪失了C類基因的功能，從而使雄蕊轉變成花瓣，雌蕊轉變成葉狀結構。不過在本研究得到的CDS序列中，ahHfAG、qhHfAG編碼肽鏈只含有AG基序Ⅰ而沒有AG基序Ⅱ。盡管AG基序的丟失可能會造成C類基因功能的喪失，從而形成重瓣花，但是對比單瓣、重瓣萱草序列可以發現，二者均缺失基序Ⅱ，說明該基序Ⅱ的缺失并不是造成重瓣的根本原因。通過二級結構預測的對比可以發現，氨基酸的突變導致基序Ⅰ(第196位到第207位)二級結構第 194～197位由α-螺旋變為無規則卷曲，第 201～203位由無規則卷曲變為α螺旋?；蛟S基序Ⅰ對于重瓣表達有更重要的作用，這可能是產生重瓣的原因之一。根據系統進化樹可以看出，ahHfAG基因屬于AGL亞家族中C類基因的AG譜系，參與雄蕊、心皮的發育，與掃帚蘆筍的親緣關系最近，說明其遺傳背景較為相似。ahHfAG基因與qhHfAG基因序列有2個氨基酸的差異，該差異導致蛋白質二級結構、三級結構及疏水性發生變化，這也許是導致花型變異的一個內在因素。接下來可以將ahHfAG基因轉入擬南芥和煙草中，進行進一步的功能鑒定。

本試驗克隆的萱草HfAG基因為研究觀花植物的重瓣機制奠定了基礎，同時也為進一步通過基因工程開展萱草重瓣新品種育種提供了理論和試驗依據。