InDel 標(biāo)記在蘿卜雜交種圓都1 號(hào)純度鑒定中的應(yīng)用

方小雪，張鋮鋒，吳新勝

（寧波微萌種業(yè)有限公司 浙江寧波 305101）

蘿卜（Raphanus satirusL.）屬十字花科，一年或二年生草本植物，主要以膨大的肉質(zhì)直根作為產(chǎn)品器官，富含糖、維生素和蘿卜硫素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有一定的藥用食療價(jià)值[1]。我國(guó)蘿卜種植區(qū)域遍布南北各省，常年種植面積達(dá)120 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量約4000 萬(wàn)t，是主要的大宗蔬菜作物之一[2]。蘿卜雜交品種兼具抗病性強(qiáng)、商品性好和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，有良好的經(jīng)濟(jì)效益，是目前我國(guó)栽培蘿卜的主要類型。圓都1 號(hào)蘿卜是由寧波微萌種業(yè)有限公司在2018 年培育的雜交新品種，具有肉質(zhì)脆甜爽口、不易糠心和耐抽薹等特點(diǎn)。至2021 年，圓都1 號(hào)蘿卜種子銷售量逐年增長(zhǎng)，在浙江、江蘇、上海、安徽等地均有種植。蘿卜雜交種圓都1 號(hào)的進(jìn)一步推廣需要更多優(yōu)質(zhì)種子作為保障，同時(shí)也需要高效精準(zhǔn)的種子檢測(cè)技術(shù)作為支撐。

雜種優(yōu)勢(shì)在生物界普遍存在，是指雜合體在一種或多種性狀上優(yōu)于兩個(gè)親本的現(xiàn)象[3]。雜種優(yōu)勢(shì)利用作為遺傳應(yīng)用的典型代表，已在水稻、玉米和小麥等作物中取得了豐碩成果[4-6]。近年來(lái)，蘿卜的雜種優(yōu)勢(shì)利用逐漸受到重視，已有多個(gè)性狀優(yōu)良的蘿卜雜交新品種上市。在蘿卜雜交制種過(guò)程中，常因混入親本自交種子或其他品種種子等生物學(xué)混雜問(wèn)題而降低種子純度，進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，種子純度鑒定是保證蘿卜雜交種質(zhì)量的必要檢測(cè)流程，也是蘿卜雜交種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的堅(jiān)實(shí)保障。目前，我國(guó)蘿卜種子純度鑒定主要以田間表型鑒定為主，該鑒定方法極易受環(huán)境因素干擾，存在田間表型特征不易把握和耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題[7]。根據(jù)種子純度鑒定的發(fā)展方向，結(jié)合現(xiàn)有的技術(shù)手段，急需建立一種能快速精準(zhǔn)鑒定蘿卜雜交種種子純度的方法。

InDel（Insertion/Deletion，InDel）多態(tài)性分子標(biāo)記是基于插入或缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的標(biāo)記[8]。過(guò)去，SSR 分子標(biāo)記作為主要的分子標(biāo)記技術(shù)，早已在黃瓜、甜瓜和蘿卜等作物的純度鑒定中成功應(yīng)用[9-11]。但應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記做純度鑒定的工作相對(duì)繁瑣，需要從大量的引物庫(kù)中篩選，會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間和精力。相比SSR 標(biāo)記，InDel 標(biāo)記不僅設(shè)計(jì)引物的工作量明顯減少，而且擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型清晰簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性和分離效果更佳[12]。近年來(lái)，InDel 標(biāo)記已成功應(yīng)用于青梗菜、甘藍(lán)等作物的種子純度鑒定，檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性均得到驗(yàn)證[13-14]。由此可知，應(yīng)用InDel 標(biāo)記開(kāi)展蘿卜雜交種的純度鑒定工作是可行的。

筆者基于蘿卜全基因組數(shù)據(jù)（Raphanus sativus（assembly Rs1.0））對(duì)蘿卜雜交種圓都1 號(hào)親本（父本：2348M832，母本：V01A107238）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，通過(guò)對(duì)比分析父本與母本的重測(cè)序結(jié)果，利用二者間的差異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記引物，以此進(jìn)行圓都1 號(hào)蘿卜的純度鑒定。通過(guò)與田間表型鑒定結(jié)果相互驗(yàn)證，以期開(kāi)發(fā)出具有實(shí)用性的InDel 分子標(biāo)記，為以后開(kāi)展大規(guī)模蘿卜雜交種純度鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為圓都1 號(hào)蘿卜種子，由寧波微萌種業(yè)有限公司雜交制種后所得；父本2348M832 由福建省福州市閩侯縣的地方蘿卜品種原白蘿卜經(jīng)5 代自交分離、純化后所得；母本V01A107238 由浙江省上虞縣地方品種湖田蘿卜經(jīng)4 代自交分離、純化后所得。

1.2 器材與試劑

器材：離心管（規(guī)格：2.0 mL、1.5 mL）、鋼珠（直徑：2 mm）、多組織研磨儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液槍、PCR 板、PCR 儀、電泳儀、電泳槽、BIO-RAD 凝膠成像儀。試劑：CTAB DNA 提取液、NaHSO3、異戊醇、CHCl3、ddH2O、異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、電泳液、2×TaqMaster Mix、Maker I。

1.3 方法

1.3.1 田間小區(qū)種植 2021 年11 月20 日將圓都1號(hào)雜交種播種于寧波微萌種業(yè)有限公司邱隘農(nóng)場(chǎng)設(shè)施大棚內(nèi)，父、母本各種25 株，株距和行距分別為15 cm 和20 cm，栽培面積約60 m2，共計(jì)360 株。植株生長(zhǎng)期間有2 株缺失，剩余358 株作為試驗(yàn)對(duì)象。

1.3.2 田間純度鑒定方法 田間358 株圓都1 號(hào)蘿卜植株播種后35 d 開(kāi)始觀察植株田間表型性狀，3～5 d 觀察1 次，共3 次。

1.3.3 DNA提取 于2022 年1 月10 日，隨機(jī)選取圓都1 號(hào)蘿卜及其父、母本植株各10 株，用打孔器在植株新展開(kāi)功能葉上取樣，獲得蘿卜圓都1號(hào)及其父、母本的混合樣品，并置于裝有鋼珠（直徑2 mm）的2 mL 離心管內(nèi)。離心管置于多樣品組織研磨儀內(nèi)，設(shè)置60 Hz 并運(yùn)行90 s 獲得樣品勻漿。勻漿中加入700 μL 含有NaHSO3（NaHSO3濃 度10.4 g · L-1）的CTAB 溶液，并 以65 ℃水 浴30 min。水浴后，加入700 μL CHCl3和異戊醇混合液（CHCl3與異戊醇的體積比為24∶1）并離心（8000 r·min-1，10 min），提取400 μL 上清液置于1.5 mL 離心管。上清液加入預(yù)冷異丙醇（IPA）300 μL 并離心（12 000 r·min-1，10 min），倒出上清液留底，以75%乙醇漂洗后風(fēng)干，用ddH2O 溶解獲得DNA 水溶液，即混合基因池。

于2022 年1 月23 日，從待測(cè)的358 株圓都1號(hào)蘿卜的新葉上取樣，以CTAB 法提取DNA，純度檢測(cè)后以ddH2O 溶解稀釋至100～200 ng·μL-1，存放于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 全基因組重測(cè)序及InDel 位點(diǎn)篩選 父、母本混合基因池送到天津諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)（raw data）。原始數(shù)據(jù)去除接頭序列和數(shù)據(jù)質(zhì)控后獲得clean data，并通過(guò)BWA 軟件比對(duì)蘿卜全基因組數(shù)據(jù)，對(duì)父、母本變異位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比和篩選，其結(jié)果用SAMTOOLS 軟件去除重復(fù)并檢測(cè)InDel 位點(diǎn)，軟件ANNOVAR 對(duì)InDel 位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋[15]。

1.3.5 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)重測(cè)序預(yù)測(cè)到的InDel位點(diǎn)，選取父本缺失、母本無(wú)變異的InDel＞40 bp 的位點(diǎn)，利用Primer Premier 5.0 軟件在差異位點(diǎn)兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。為確保擴(kuò)增的特異性，引物設(shè)計(jì)參數(shù)特別考慮GC 含量40%～50%，退火溫度50～60 ℃，引物片段長(zhǎng)度17～25 bp，引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度200～300 bp。

1.3.6 PCR 體系和電泳 PCR 擴(kuò)增采用近岸蛋白質(zhì)科技有限公司的2×TaqMaster Mix。PCR體系為20 μL：DNA 模板1.5 μL（DNA 質(zhì)量濃度100～200 ng·μL-1），正反向引物各1.5 μL（引物質(zhì)量濃度10 ng·μL-1），2×TapMaster Mix 10 μL，超純水5.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，51.5 ℃退火20 s，72 ℃延 伸40 s，循 環(huán)35 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用A3-1大型凝膠電泳系統(tǒng)，設(shè)置350 V 電壓和500 mA 電流，以4%瓊脂糖凝膠電泳50 min，最后通過(guò)BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.7 計(jì)算公式 純度/%=（檢測(cè)總量-雜株數(shù)量）/檢測(cè)總量×100； （1）

吻合率/%=（室內(nèi)結(jié)果/田間結(jié)果）×100。（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

通過(guò)對(duì)圓都1 號(hào)蘿卜親本進(jìn)行全基因組重測(cè)序，篩選InDel 位點(diǎn)并設(shè)計(jì)出6 對(duì)引物（表1）。6 對(duì)引物對(duì)圓都1 號(hào)蘿卜及其父、母本的DNA 樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。根據(jù)電泳結(jié)果，引物L(fēng)-1 父本擴(kuò)增不出條帶被淘汰；引物L(fēng)-5和L-6 親本間擴(kuò)增條帶無(wú)多態(tài)性被淘汰。引物L(fēng)-2、L-3 和L-4 在父本和母本間的擴(kuò)增條帶都存在特異性，雜交種圓都1 號(hào)可擴(kuò)增出父、母本2 個(gè)條帶；但引物L(fēng)-3 父本和母本間的擴(kuò)增條帶差異較小，電泳檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；引物L(fēng)-2 在雜交種圓都1 號(hào)存在非特異性擴(kuò)增條帶，只有引物L(fēng)-4 帶型清晰且電泳檢測(cè)時(shí)間合理。因此，試驗(yàn)最終選定引物L(fēng)-4 用于蘿卜雜交種圓都1 號(hào)的純度鑒定，其父本和母本擴(kuò)增片段大小分別為254 bp 和297 bp。

表1 6 對(duì)蘿卜InDel 標(biāo)記信息

圖1 不同引物對(duì)圓都1 號(hào)蘿卜及其父、母親本DNA 樣品的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 引物L(fēng)-4檢測(cè)圓都1號(hào)蘿卜植株純度

利用引物L(fēng)-4 對(duì)田間358 株圓都1 號(hào)蘿卜進(jìn)行純度檢測(cè)，其中編號(hào)為26、85、121、257、284 的蘿卜植株均只擴(kuò)增出母本條帶，其余353 株蘿卜均為F1型雙條帶，其中編號(hào)121～168 與241～288 蘿卜植株的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。因此，通過(guò)純度鑒定計(jì)算，可以獲得該批圓都1 號(hào)蘿卜的純度為98.60%。

圖2 引物L(fēng)-4 檢測(cè)圓都1 號(hào)蘿卜部分植株的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 田間表型鑒定圓都1號(hào)蘿卜植株純度

圓都1 號(hào)蘿卜雜交種植株的田間表型為葉叢半直立、葉色綠、株幅大、裂刻中；蘿卜圓都1 號(hào)母本植株的田間表型為葉叢半直立、葉色深綠、株幅小、裂刻中；二者的肉質(zhì)根皮色和肉色均為白色。異花粉雜株無(wú)特定的田間表型性狀，需要與F1在葉色、株幅和肉質(zhì)根顏色等表型性狀上全面比較。通過(guò)對(duì)田間358 株蘿卜植株的長(zhǎng)勢(shì)、葉色和株幅等性狀進(jìn)行鑒定，有8 株因長(zhǎng)勢(shì)較弱、葉色深綠、株幅小等特點(diǎn)被鑒定為母本或異花粉雜株，獲得純度為97.77%。圖3 中，白框內(nèi)的蘿卜相比其他植株葉色更深和株幅更小，因此被鑒定為雜株。

圖3 圓都1 號(hào)蘿卜與親本雜株田間表型鑒定

2.4 InDel標(biāo)記檢測(cè)與田間表型鑒定純度結(jié)果對(duì)比

通過(guò)引物L(fēng)-4 分子檢測(cè)與田間表型鑒定對(duì)358株蘿卜植株開(kāi)展純度檢測(cè)，純度結(jié)果如表2 所示。引物L(fēng)-4 分子鑒定有5 株母本或異花粉雜株，純度為98.60%；田間表型鑒定有8 株雜株，純度為97.77%。引物L(fēng)-4 分子鑒定與田間鑒定的結(jié)果對(duì)比，編號(hào)為156、166、229 的3 株植株鑒定結(jié)果存在差異，其余350 株圓都1 號(hào)雜交種和5 株雜株的檢測(cè)結(jié)果一致，吻合度高達(dá)99.16%。

表2 圓都1 號(hào)蘿卜InDel 標(biāo)記與田間表型觀察鑒定純度結(jié)果對(duì)比

2.5 InDel標(biāo)記與田間表型鑒定結(jié)果差異分析

對(duì)編號(hào)為156、166、229 的3 株植株再通過(guò)引物L(fēng)-4 分子檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示，擴(kuò)增出父本和母本2 條條帶。同時(shí)，留存編號(hào)156、166、229 植株繼續(xù)生長(zhǎng)以待后續(xù)繼續(xù)觀察，3 周后其表型開(kāi)始與F1一致。因此，引物L(fēng)-4 能夠代替田間表型鑒定對(duì)圓都1 號(hào)蘿卜做純度鑒定。

圖4 InDel 標(biāo)記對(duì)田間鑒定母本雜株的驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

種子純度是雜交種質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，直接影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。純度鑒定作為保障種子純度的必要流程，目前主要以田間表型鑒定和分子標(biāo)記等方式對(duì)種子純度做出鑒定[16]。

在田間表型鑒定過(guò)程中，需要在植株不同生長(zhǎng)階段進(jìn)行多人多次鑒定，從而降低人為主觀臆想和環(huán)境變化等因素對(duì)鑒定結(jié)果帶來(lái)的誤差。筆者試驗(yàn)中，編號(hào)156、166、229 植株因長(zhǎng)勢(shì)弱、葉色較深被鑒定為母本或異花粉雜株，與分子檢測(cè)結(jié)果不同。在實(shí)際蘿卜栽培中，無(wú)法為每個(gè)植株提供相同且適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，局部的土壤肥力缺失或病蟲害脅迫均會(huì)影響圓都1 號(hào)蘿卜的正常生長(zhǎng)。已有大量的研究結(jié)果表明，不適宜的生長(zhǎng)環(huán)境或脅迫條件下植株的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，其葉面積大幅減小，葉色加深[17-18]。因此，可能是因局部不利的生長(zhǎng)環(huán)境造成編號(hào)156、166、229 蘿卜植株的表型性狀與母本相似，從而影響田間表型的鑒定判斷。

SSR 分子標(biāo)記因引物廣譜性好、操作簡(jiǎn)單和成本低等特點(diǎn)，一直是重要的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，已在水稻、油菜、西瓜和棉花等作物的種子純度鑒定中被廣泛應(yīng)用[19]。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，InDel 標(biāo)記逐漸被人所熟知，并成功應(yīng)用于青梗菜、甘藍(lán)等蔬菜作物的純度鑒定。InDel 標(biāo)記的多態(tài)性相比SSR 標(biāo)記要低，其帶型簡(jiǎn)單、分布較密，在遺傳分析或基因診斷中的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和分辨率大大提高[20]。目前，SSR 分子標(biāo)記已成功應(yīng)用于北斗75和七星蘿卜品種的雜交種純度鑒定[21-22]，但應(yīng)用In-Del 標(biāo)記開(kāi)展蘿卜雜交種純度鑒定尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。筆者在圓都1 號(hào)蘿卜全基因組重測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用父母本間的InDel 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以此利用InDel 分子標(biāo)記對(duì)蘿卜雜交種進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果顯示，InDel 標(biāo)記檢測(cè)與田間表型鑒定結(jié)果吻合度高達(dá)99.16%，且檢測(cè)結(jié)果直觀快速，無(wú)人為主觀臆想和環(huán)境因素的干擾。因此，InDel 標(biāo)記能夠應(yīng)用于蘿卜雜交種圓都1 號(hào)的純度鑒定，并兼具高效性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。

高效準(zhǔn)確的InDel 標(biāo)記純度檢測(cè)有助于圓都1號(hào)蘿卜的快速推廣，并顯著減少公司在純度鑒定中所需的時(shí)間和精力。在實(shí)際應(yīng)用中，考慮到分子標(biāo)記純度鑒定需要高通量快速進(jìn)行，設(shè)計(jì)InDel 引物時(shí)應(yīng)綜合考量擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量、穩(wěn)定性和分離速度。筆者從引物設(shè)計(jì)、引物篩選、大規(guī)模檢測(cè)、田間表型鑒定結(jié)果比對(duì)和再驗(yàn)證等流程出發(fā)，對(duì)如何應(yīng)用InDel 標(biāo)記開(kāi)展蘿卜雜交種圓都1 號(hào)鑒定工作進(jìn)行了系統(tǒng)性闡述，也為今后其他雜交種應(yīng)用InDel標(biāo)記提供了借鑒。