Fstl1在肺部疾病中的研究進展

康海藝 劉輝 周源

Fstl1是一種胞外糖蛋白，也是一種分泌型骨形態發生蛋白(BMP)拮抗劑，在文獻中，Fstl1有許多不同的名稱，如轉化生長因子β1誘導蛋白 36(TSC-36)或者卵泡抑素相關蛋白(Follistatin-Related Protein FRP)等。最早是由Shibanuma等[1]利用轉化生長因子β1 刺激小鼠成骨細胞系MC3T3-EL而分離出來的一種相對分子質量約35kDa的分泌性糖蛋白，屬于BM40/SPARC/Osteonectin家族蛋白的一員，位于3q13染色體,編碼308個氨基酸，其氨基末端由12個氨基酸殘基組成。該蛋白具有4個N-糖基化位點和2個O-糖基化位點。Fstl1包含一個卵泡抑素(FS)樣結構域和一個細胞外鈣(EC)結構域，而細胞外鈣結構域后緊密相連的C端存在一個與血友因子同源性的結構域。有研究證實，由于Fstl1的EC結構域缺乏鈣結合特性，因此Fstl1與SPARC蛋白家族的其他成員在功能上有所不同[1-3]。

一、Fstl1的生物學功能

Fstl1的生物學功能及作用機制目前仍不明確，許多文獻已證實Fstl1參與調控細胞發育、增殖、分化、遷移、凋亡、癌變等多種生物學過程。在生長發育方面，Fstl1的缺失可導致小鼠出生后因呼吸衰竭而死亡，或出生后患有多種骨骼相關疾病[4]。Fstl1的表達下調，會導致前體脂肪細胞向脂肪細胞轉化，從而導致非胰島素依賴型糖尿病、高血壓、心肌梗塞和某些類型癌癥等疾病發生[5]。在腫瘤方面，Fstl1 在不同的惡性腫瘤中的表達是不同的。在鼻咽癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]及卵巢癌[9]等腫瘤中Fstl1的表達上調具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲的作用，而在前列腺癌[10]、膠質細胞瘤[11-12]、直腸癌[13]和轉移性骨腫瘤[14]等腫瘤中，Fstl1的上調反而會促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。

二、Fstl1對肺部發育作用

Fstl1在肺生長發育過程中起著至關重要的作用，已有多個研究證實Fstl1的缺失會導致肺發育不全。Adams等[15]通過對小鼠肺胚胎的觀察發現氣道周圍的肺間充質中有Fstl1的高水平的表達，通過對相鄰切片的α-SMA染色及CD31染色發現這種高水平的表達主要存在于氣道周圍的平滑肌層以及血管壁中。Geng等[16]通過研究Fstl1基因缺陷的小鼠，所有純合的小鼠在出生后不久死亡。從氣管切片上觀察到Fstl1-/-缺失的小鼠氣管畸形，但這不是Fstl1-/-小鼠呼吸衰竭的主要原因。他們觀察到Fstl1-/-的小鼠肺泡球囊上的AEC-Ⅱ細胞是未分化成熟的，其表面活性物質產生減少，從而導致Fst11-/-小鼠肺不張。其機制可能為Fstl1通過負調控BMP4/Smad1/5/8信號調節肺AEC-Ⅱ細胞分化。Sylva等[17]的實驗數據與Geng等[16]的實驗數據部分相同，進一步證實Fstl1在肺發育中的重要作用。他們通過體外實驗發現，加入BMP抑制劑Noggin可以改善Fstl1-/-小鼠肺不張，機制可能是Fstl1的缺失破壞了BMP和FGF信號轉導的平衡。因為Fstl1在肺發育中起著拮抗BMP4信號的重要作用，Li等[4]建立了SFTPC-Fstl1轉基因小鼠，該鼠在肺發育的所有階段都表現出明顯的 Fstl1 上皮過表達。然而這種過表達并沒有改變Fstl-/-小鼠的肺不張。其原因為Fstl1的過表達不能降低小鼠肺中的BMP4誘導的磷酸化Smad1/5/8的水平。隨后在成年轉基因SFTPC-Fstl1小鼠的肺泡灌洗液中檢測到大量Fstl1，表明轉基因小鼠BMP信號的無效抑制與上皮細胞頂端分泌Fstl1有關。通過對上皮細胞頂端分泌Fstl1研究，發現只有在上皮細胞的基底外側同時給予 Fstl1 和 BMP4,才能抑制 BMP4 誘導的 Smad1/5/8 磷酸化。由于純合子Fstl1基因敲除的小鼠出生時就會死于呼吸衰竭，Tania等[18]通過研究內皮特異性敲除小鼠 (Fstl1-eKO mice)發現70%的Fstl1-eKO的小鼠出生后3周死亡。為了研究其死亡原因，實驗研究發現內皮細胞中Fstl1的缺失，阻止了肺小血管中肌動蛋白的合成，從而延緩了肺血管的成熟。其機制為：低水平的Fstl1表達導致BMP介導的Smad磷酸化增加，導致下游靶標Jagged1、endoglin、Gata2和Endothelin-1的升高，從而延緩肺血管成熟。Liu等[19]通過建立Fstl1-LacZ小鼠品系以及Fstl1-/-小鼠品系，發現Fstl1-/-會導致氣道平滑肌(ASM)及肺血管平滑肌(VSM)嚴重畸形，其機制為Fstl1通過關鍵轉錄因子SRF和肌鈣蛋白正向調節α-SMA的表達和ASM的分化。他們的實驗表明Fstl1在ASM的正常形成和VSM的發育中起著重要作用。

圖1 Fstl1蛋白質結構圖

圖2 Fstl1調節BMP4信號通路示意圖

三、Fstl1對肺部感染性疾病的作用

Henkel等[20]通過對肺炎克雷伯桿菌感染野生型(WT)小鼠和Fstl1亞效等位基因(Hypo)小鼠(一種Fstl1功能降低的小鼠)的研究發現， Fstl1表達降低可以促進IL-17A的表達從而控制肺炎克雷伯桿菌感染，其具體機制不詳。Chen[21]等通過體內、外模型研究證實Fstl1表達水平下調可降低骨髓巨噬細胞感染肺炎鏈球菌后的炎癥損傷。其機制為下調Fstl1后可抑制NLRP3和TLR4/NF-κB信號通路，對肺炎鏈球菌感染所致的炎癥損傷具有保護作用。

四、Fstl1對急性肺栓塞(PE)的作用

Liao等[22]對220例急性PE患者進行前瞻性觀察隊列研究，運用酶聯免疫吸附法測定血漿中Fstl1水平,通過多因素Cox回歸分析等發現，血漿Fstl1水平與急性PE患者的病情嚴重程度相關，并可預測30天內死亡的風險。

五、Fstl1對肺動脈高壓的作用

Zhang等[23]通過對COPD組、COPD合并肺動脈高壓組及對照組患者的血清Fstl1水平進行分析，發現前兩組Fstl1水平均高于對照組，且COPD合并肺動脈高壓組高于COPD組。在動物實驗中，將Fstl1+/-小鼠置于低氧環境，發現Fstl1+/-小鼠右室收縮壓、肺動脈肌化和右室肥厚指數增加，隨后予Fstl1+/-小鼠尾靜脈注射重組人Fstl1蛋白，觀察到上述癥狀得到明顯好轉。在培養的人肺動脈平滑肌細胞(PASMC)中觀察到，Fstl1可抑制缺氧所誘導的PASMCs異常增殖和遷移。為明確其抑制的主要分子機制，通過對缺氧性肺血管重構的關鍵轉導因子：Smad1/5/8、絲裂原激活蛋白激酶(ERK、p38激酶和Jun-N末端激酶)和AMP激活蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平等的實驗，發現Fstl1完全敲除后，會導致缺氧的PASMCs中p-ERK的激活，從而加重低氧型肺動脈高壓。以上研究證實Fstl1對于低氧型肺動脈高壓具有潛在保護作用。Liu等[24]在COPD患者及CS(香煙煙霧)暴露的小鼠模型的血清及肺組織樣本的研究發現，Fstl1水平升高且與自噬小體的自噬激活呈正相關，在CS暴露小鼠上使用自噬抑制劑3-MA和/或敲除Fstl1單倍體，發現自噬抑制劑及Fstl1缺失均可減輕CS暴露小鼠的氣道炎癥和氣道重塑反應，具體機制不詳，但靶向Fstl1和自噬可能有助于治療CS誘導的COPD。

六、Fstl1對哮喘疾病的作用

Miller等[25]通過實驗發現，Fstl1在重度慢性哮喘的患者肺組織中高水平表達，在哮喘的小鼠動物模型上，M2巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞可高表達Fstl1，且Fstl1還通過自分泌或旁分泌途徑誘導巨噬細胞、成纖維細胞或上皮細胞進一步表達Fstl1。通過體外實驗證實Fstl1能直接誘導骨髓中的巨噬細胞表達抑癌素M(OSM)。其機制為Fstl1通過誘導其通路下游OSM來加重慢性哮喘小鼠的氣道重塑、嗜酸性粒細胞性炎癥和AHR。Liu等[26]在對32例哮喘患者和25例對照組患者的血漿、肺泡灌洗液的Fstl1水平及支氣管活檢組織的免疫組化染色和定量分析中表明，Fstl1可作為哮喘的血液生物標志物，在哮喘的診斷中有一定的實用價值，并且通過治療組和未治療組的血漿Fstl1濃度對比，發現隨著哮喘好轉，血漿Fstl1水平逐漸降低，表明Fstl1可能促進哮喘患者的氣道重構。他們的另一項研究運用不同濃度的Fstl1重組蛋白處理16HBE細胞(人支氣管上皮細胞)，觀察到Fstl1可同時誘導自噬和上皮-間充質轉化，在16HBE細胞中使用自噬抑制劑LY294002抑制自噬，發現抑制自噬過程可以減緩Fstl1誘導的EMT和氣道重構的進展，并通過動物模型實驗進一步證實了此結論；同時他們還發現Fstl1的缺失和LY-294002的治療對乙酰甲膽堿誘導的AHR具有保護作用[27]。Deng等[28]通過對細胞層面的實驗發現，Fstl1的敲除可直接抑制ASM細胞的血小板源性生長因子亞基B(PDGF-BB)，從而治療兒童哮喘。Fstl1的敲除可抑制PDGF-BB誘導的p-EPK和p-AKT蛋白表達水平，減少ASM細胞的增殖和遷移。Wang等[29]通過對哮喘小鼠的研究發現，Fstl1會激活巨噬細胞所誘導NLRP3/IL-1β信號，從而加重過敏性氣道炎癥反應，而運用siFstl1或MCC950(NLRP3特異性拮抗劑)預處理后，可明顯抑制NLRP3和IL-1β的表達，進一步減輕支氣管炎癥損傷。以上實驗研究表明Fstl1有望成為評估治療哮喘疾病的血液生物標志物，或成為緩解哮喘疾病的靶向治療藥。

七、Fstl1對肺氣腫疾病的作用

Henkel[30]等通過研究Fstl1 Hypo小鼠(Fstl1表達降低小鼠)發現Fstl1表達降低會導致小鼠出現自發性肺氣腫，且吸煙暴露不會加劇Fstl1 Hypo小鼠的肺氣腫情況。為明確機制，作者通過實驗，發現Fstl1的表達降低使得肺免疫細胞中的炎癥抑制因子Nr4a1/Nur77表達降低，從而直接影響巨噬細胞中的NF-B信號轉導。而給予外源性的Fstl1后，會顯著增加Nr4a1的表達。該文為深入了解Fstl1信號的候選分子提供了實驗依據，為Fstl1在肺部疾病中的治療潛力提供了實驗基礎。

八、Fstl1對肺纖維化疾病的作用

研究發現,TGF-β1和BMP信號通路都在肺纖維化的發生和發展中發揮重要作用[31-32]。Dong等[33]通過博萊霉素誘導Fstl1+/-小鼠產生肺纖維化，發現在肺損傷后，Fstl1作為促纖維化因子參與并驅動肺纖維化的發生。而Fstl1的缺失不僅減輕了BLM所致的纖維化，還恢復了TGF-β1/BMP的平衡，從而保護了上皮細胞。隨后他們選擇Fstl1的中和抗體22B6 mAb進行進一步的研究。結果表明，22B6 mAb可抑制Fstl1，從而維持TGF-β1/BMP的平衡，并調節上皮-間充質轉化。Zheng等[34]通過對小鼠正常肺成纖維細胞和博萊霉素處理后14d的小鼠肺成纖維細胞進行檢查，發現在BLM處理后的小鼠肺成纖維細胞Fstl1表達更高。通過生物信息分析及體內外實驗等發現，在Fstl1啟動子-591到-350bp區域內，存在C-jun、SPl結合位點，通過功能喪失和功能獲得實驗，證實C-jun表達升高，會顯著刺激Fstl1 mRNA及蛋白的表達，因此TGF-β1通過誘導Smad3/C-jun通路促進Fstl1表達，從而促進肺纖維化的發生。Chen等[35]對有癥狀的RIPF(放射性肺纖維化)患者的血清、輻射損傷的恒河猴和小鼠的肺組織中Fstl1蛋白和信使RNA水平進行評估，發現Fstl1表達水平均升高，同時在Fstl1+/-小鼠中同樣予以相同劑量的肺輻射，并檢測Fstl1的表達水平，與野生型小鼠對照組對比，發現Fst11缺陷對小鼠放射性肺損傷具有保護作用。從野生型小鼠和Fstl1+/-小鼠中分離出原代肺成纖維細胞，用單劑量8 Gy治療24 h后，通過Western blot檢測Fstl1蛋白表達水平表明，Fstl1的缺乏不僅限制了輻射誘導的肌成纖維細胞的堆積，還降低了輻射相關的α-SMA蛋白的水平，從而抑制肌成纖維細胞的分化及細胞外基質的產生。Li等[36]發現單克隆中和抗體(NAB)能夠阻斷Fstl1所致的肺纖維化。他們通過給博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠模型注射兩種Fstl1中和抗體：2K6或4D22，發現Fstl1 nAb治療顯著降低了肺纖維化，但Fstl1 nAb不能起到預防肺纖維化的作用。其機制為這兩種nAbs阻斷了Fstl1介導的間質細胞激活，逆轉了肺纖維化和炎癥的反應。Jin等[37]發現Fstl1是一種促纖維化蛋白，可通過p38-JNK- Smad2/3信號通路調控TGF - β1促進成纖維細胞的分化、增殖、遷移和侵襲。Fang等[38]在矽肺小鼠模型及矽肺患者血清中測得Fstl1表達上調，通過對使用中和抗體阻斷Fstl1的矽肺小鼠模型及Fstl1單倍體缺失的矽肺小鼠模型相關實驗數據對比，發現都可減輕小鼠體內二氧化硅誘導的肺部炎癥及纖維化。阻斷或敲除Fstl1可降低體內NLRP3的表達、caspase-1活性和隨后的IL-1β分泌。這些研究表明，Fstl1有潛力作為肺纖維化的治療工具。

九、Fstl1與非小細胞肺癌的關系

目前關于Fstl1與非小細胞肺癌關系的研究較少，對Fstl1在非小細胞肺癌組織中的表達情況、作用機制等，各研究結果也不一致。有研究表明，連接蛋白基因已經被歸類為腫瘤抑制基因[39-40]。Zhao等[41]發現，Cx43除了具有抑制腫瘤生長的作用外，還具有抑制腫瘤侵襲和轉移的作用，而Cx43的抑制作用是通過調節Fstl1的分泌而抑制PG細胞的侵襲和轉移，Cx43的抑制作用依賴Fstl1的分泌。Ni等[42]檢測了一組非小細胞肺癌細胞系和肺正常上皮細胞系中Fstl1的表達，發現Fstl1在NSCLC細胞中的表達較正常對照組下調。Fstl1改變了Fas/FASL、caspases和MMPs等與細胞凋亡和侵襲相關的關鍵因子，從而通過改變細胞周期和增加凋亡來抑制NSCLC細胞的增殖。

也有研究發現，Fstl1的下調強烈地預示著肺腺癌患者的預后較差。Chiou等[8]通過實驗發現細胞外抗體中和Fstl1可增加肺癌細胞的遷移/侵襲能力，而加入重組Fstl1蛋白則可降低肺癌細胞的體內外轉移能力。運用Fstl1治療可以有效地阻止肺癌細胞的轉移進展。其機制為Fstl1直接與新生SPP1結合，抑制其被基質金屬蛋白酶-3/7或凝血酶蛋白酶蛋白水解成活性SPP1的過程，阻止SPP1誘導的轉移癌細胞中avb3整合素和CD44的活化，從而抑制了LUAD(肺腺癌)細胞的轉移進程。

而在有吸煙史的的LUAD患者中，Fstl1的低表達更為常見。 Chiou等[43]發現Fstl1通過調節Fstl1-BMP4-Smad通路在肺腺癌中發揮重要作用。而低表達的Fstl1、BMP4及Smad在肺腺癌中顯示出預后不良的趨勢，在有吸煙史的LUAD患者中更常觀察到低Fstl1，BMP4和Smad4表達。通過用尼古丁處理正常細胞BEAS2B和肺癌細胞株BEAS2B發現尼古丁能通過ERK/MAPK信號通路促進肺癌細胞的增殖。而Fstl1可抑制尼古丁誘導的肺癌細胞增殖。

相反的，有研究發現，阻斷Fstl1可以有效誘導抗腫瘤免疫，特別是在轉移性腫瘤中。Chie等[44]運用轉移模型比較了抗Fstl1單克隆抗體和IC抑制劑(抗CTLA4、抗PD1和抗PDL-1單克隆抗體)的抗腫瘤效果，在誘導抗轉移免疫方面，抗Fstl1治療優于IC抑制劑治療，且阻斷Fstl1能更有效抑制老年小鼠的癌癥進展。在腫瘤培養中加入抗Fstl1單抗也可抑制細胞增殖并增強對CTL殺傷的敏感性。實驗結果提示Fstl1和DIP2A共陽性的腫瘤細胞可以通過自分泌Fstl1的方式來維持腫瘤惡性特性，而且還可以損害宿主的免疫功能。因此，破壞Fstl1-DIP2A軸可以通過控制腫瘤特性和免疫平衡來有效地消除癌癥。抗Fstl1單抗可用于癌癥的治療，其機制不同于臨床上以IC通路為靶點的機制，至少在非小細胞肺癌中是如此。

也有研究表明，阻斷Fstl1可誘導非小細胞肺癌(NSCLC)細胞死亡。Bae等[45]在NSCLC細胞(NCI-H460、NCI-H2228和A549)中根據Western blotting測定的PARP裂解結果，發現細胞死亡率最高的為NCI-H460細胞，隨后用NCI-H460細胞來評估Fstl1基因敲除誘導的細胞死亡發現，Fstl1基因敲除可誘導細胞周期阻滯于G2/M期，細胞周期蛋白CDK表達上調。進一步研究了細胞周期進程的影響，發現阻斷Fstl1抑制了ERK1/2的激活，從而抑制了Bim磷酸化導致Bim亞型的積聚。

以上研究表明 Fstl1 對非小細胞肺癌具有雙調控作用，既可抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用，也可通過敲除Fstl1從而有效誘導抗腫瘤免疫或誘導癌細胞的死亡，但具體機制仍需進一步研究。

十、結束與展望

目前，Fstl1在腫瘤及炎癥性疾病中具有大量的研究，但對于其與肺部疾病的關系及其作用機制的研究仍較少且具有爭議。而明確 Fstl1與肺部疾病的關系、作用和調控機制，可能會為肺部疾病的治療、診斷及預后提供理論依據。尤其是在肺纖維化疾病哮喘及非小細胞肺癌中，仍需要進一步研究 Fstl1的具體作用機制及調控通路。這將會為以后診斷或治療肺纖維化、哮喘及非小細胞肺癌提供一個新方向。