魚皮膠原蛋白的提取、特性及其應用研究進展

竇容容，趙春青，李桂敏，顏子恒，亢春雨*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.保定開放大學，河北 保定 071001）

膠原蛋白是一種重要的生物高分子物質，是一種白色、不透明、無分支的纖維蛋白。它通常被認為是身體生長發育的重要營養物質。膠原蛋白是人體重要的蛋白質，是骨骼、肌腱、皮膚、毛發、軟骨和關節中細胞外基質、結締組織和纖維結構蛋白的組成部分，在支持器官、保護身體、提高身體免疫力等方面發揮著不可替代的作用[1]。早期，膠原蛋白是從陸地動物的皮膚和骨骼中提取的，如牛和豬。然而，隨著牛海綿狀腦病、傳染性海綿狀腦病和口蹄疫爆發，人們擔心來自陸地動物的膠原蛋白可能引起人與陸地動物的交叉感染[2]。所以，這一系列因素限制了陸地動物膠原蛋白的廣泛應用，有必要尋找一種安全且經濟的膠原蛋白來源。水產品的副產品（如皮膚、骨頭、鰭和鱗）中富含的膠原蛋白引起了研究人員的注意。這些膠原蛋白具有良好的性能和價格優勢，未來可逐漸替代陸地動物膠原蛋白。從膠原蛋白的氨基酸組成方面分析發現，從魚類中提取的膠原蛋白的氨基酸組成和從傳統的畜禽類中提取的膠原蛋白相似，而且魚類膠原蛋白比畜禽類膠原蛋能夠更好地被人體吸收，具有更高的生物利用度[3-4]。

我國漁業產量位居世界第一，是世界第一水產養殖大國和世界第一水產品出口大國。2019年我國水產品總產量為6 480.36萬噸，加工總量達2 171.41萬噸。魚的種類不同，魚皮占魚總體重的比例則不同，以魚皮占魚總重為5%～15%來計，每年魚皮的產量約為200萬噸，在加工過程中這些魚皮被大量丟棄，造成了嚴重資源浪費和環境污染。魚皮具有低脂、無糖等的特點，富含對人體有益的氨基酸和礦物質等[5]，且魚皮中含有豐富的蛋白質，其中主要為膠原蛋白。提取魚皮中的膠原蛋白不僅可以提高魚制品的附加值還可以減少魚皮的浪費和由此引發的環境污染。

1 魚皮膠原蛋白的提取

魚皮膠原蛋白的提取主要分為3個階段：原料的預處理、膠原蛋白的提取和膠原蛋白的純化[6]。樣品的預處理主要是去除魚皮上的脂肪、雜蛋白以及脫色，然后將去除干凈的魚皮裁剪成大小相同的形狀備用；膠原蛋白的提取階段主要根據不同的提取方法進行魚皮中膠原蛋白的溶出；膠原蛋白的純化是將經過粗提得到的膠原蛋白溶液繼續處理使最后得到的膠原蛋白的純度更高，目前所研究的純化方法主要有鹽析、透析等[7]。當前常用的魚皮膠原蛋白的提取方法主要有6種：熱水法提取、堿法提取、酸法提取、酶法提取、復合法提取、輔助法提取。

1.1 熱水法提取

熱水法提取是指將預處理的魚皮直接在熱水中提取膠原蛋白的方法，熱水法提取的膠原蛋白凝膠穩定性良好，外觀為白色，無不良氣味且不會造成污染。趙睿等[8]采用熱水法提取魚皮中的膠原蛋白，并用響應面法優化工藝，得到最佳的提取工藝為pH5.0、溫度42℃、提取時間25.72h，在此條件下的提取率為83.75%。研究表明，魚類膠原蛋白的熱變性溫度較低，且變性是不可逆的。在膠原蛋白分子中，α鏈間形成的氫鍵對于三螺旋結構的穩定性有非常重要的作用，在熱水法提取過程中會使膠原蛋白的α鏈斷開，破壞膠原蛋白的三級結構，因此目前較少采用熱水法提取魚皮膠原蛋白[9]。

1.2 堿法提取

堿法提取是將含膠原蛋白的原料浸泡在氫氧化鈉或者氫氧化鈣中以提取魚皮中的膠原蛋白。利用氫氧化鈣提取堿溶性膠原蛋白，提取工藝簡單、溫度低、節省時間、不受脂肪的干擾。溫慧芳等[10]以氫氧化鈣溶液為提取液提取鮰魚皮中的膠原蛋白，結果表明膠原蛋白的最佳提取工藝為料液比 1∶10（g/mL）、Ca（OH）2添加量1.6%、70℃條件下浸提9 h，所得到膠原蛋白的提取率為79.67%。堿法提取會破壞膠原蛋白的結構，形成多孔狀的網絡結構，提取的膠原蛋白純度低，由于這種提取方法對膠原蛋白的生物活性有嚴重的損害，所以很少有人用這種方法來提取膠原蛋白。Kolodziejska等[11]通過研究堿法提取魷魚皮膠原蛋白也證實了堿性提取膠原蛋白的提取率低，且也會破壞膠原蛋白的結構。

1.3 酸法提取

酸法提取魚皮中膠原蛋白的原理是膠原蛋白分子間的鹽鍵和席夫堿結構在低濃度的酸性條件下不穩定，容易被破壞，使纖維發生膨脹和溶解，使膠原蛋白游離出來。常采用的酸有醋酸、鹽酸、檸檬酸、乳酸、草酸等低酸性溶液。在酸法提取過程中膠原蛋白不僅容易被水解甚至還會破壞其氨基酸組分，所以應嚴格控制所用酸的濃度、浸提溫度和浸提時間[12]。Bhuimbar等[13]采用乳酸溶液提取黑鰓魚皮中的膠原蛋白，得率為45%。戶業麗等[14]分別采用乳酸、醋酸、檸檬酸對鱘魚皮中的膠原蛋白進行提取，結果表明：1.0 mol/L乳酸、固液比 1∶5（g/mL）、溫度 20℃、提取時間 72 h，在此條件下提取率最高為86.18%。酸法提取是魚皮中膠原蛋白比較常用的方法，但相較于酶法提取來說提取率較低。

1.4 酶法提取

酶法提取是在一定條件下利用不同種類的酶對原材料進行酶解以得到酶溶性膠原蛋白的方法。提取原理主要是在有機酸的條件下，運用酶可以切割連接膠原蛋白末端肽鏈間的賴氨酸或羥賴氨酸相互作用而成的共價鍵，使得肽鏈展開，膠原蛋白主體依舊是三螺旋結構[15]。目前在酶法提取過程中經常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。利用酶法提取膠原蛋白具有安全性高、反應條件溫和、純度高、產物結構性質穩定、不容易變性等優點。程波等[5]分別采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶進行單因素試驗提取鱘魚皮中的膠原蛋白，試驗結果表明當用胃蛋白酶（以0.5 mol/L乙酸為溶劑）提取鱘魚皮時，在提取溫度37 ℃、提取 6 h、料液比為 1∶4（g/mL）條件下，鱘魚皮膠原蛋白的提取率最高為70.15%。Faralizadeh等[16]采用含1%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液反應48 h來提取鰱魚皮中的膠原蛋白，所得鰱魚皮膠原蛋白的得率為59%（干重）。

1.5 復合法提取

在實際膠原蛋白的提取過程中，為了保證在膠原蛋白三螺旋結構穩定性的情況下盡可能提高膠原蛋白的提取率，多數研究員在提取過程中往往將不同的提取方法進行結合以達到加快提取速率、提高提取率、降低成本的目的。例如酸法提取的膠原蛋白有無色無味和感官評價好等優點，酶法提取膠原蛋白具有安全性高、反應速率快、理化性質穩定等優點，所以可以利用酶法和酸法進行復合來提取魚皮中的膠原蛋白。在提取過程中不僅可以酸-酶復合，還可以酶-酶復合和熱水-酶復合等。王晴等[17]采用酸-酶復合法提取羅非魚皮中的膠原蛋白，結果表明最佳提取工藝為酶處理時間 15 h、酶處理溫度 50 ℃、固液比 1∶60（g/mL）、pH2時，膠原蛋白提取率最高為90.3%，研究證明該法提取的膠原蛋白溶解性能及保水性能較好，且在酸性條件下溶解性能更好。林麗等[18]研究表明酸法和堿法提取的魚皮膠原蛋白的紫外吸收峰強度較強，堿法和酶法提取的魚皮膠原蛋白的紫外吸收峰較雜等，證明復合法提取膠原蛋白不僅可以提高提取率，還可以改善膠原蛋白的理化性質。

1.6 輔助法提取

傳統的提取方法往往存在著一些問題，例如成本高、提取時間長、提取率和提取純度低等問題，所以研究者開始逐漸采用輔助方法進行提取。目前提取天然功能產物研究的輔助方法分別有超聲波輔助法、微波輔助法[19-20]。

1.6.1 超聲波輔助法

超聲波輔助提取技術作為輔助提取有效成分的一種新技術，近幾年有著較好的發展，超聲分為高強度和低強度，低強度超聲用于展示物質的理化性質，如組成、結構、物理狀態、流速等。高強度超聲波被用于促進乳化、細胞破壞、化學反應和抑制酶活性，高強度超聲具有加熱、壓縮、膨脹和湍流等特性[21]。超聲波輔助提取法的原理：借助超聲波的空化作用，提高介質的傳質速率，強化提取過程，有利于反應的進行，最終使細胞組織破壁或變形，目標分子充分溶出，達到縮短提取周期、提高純度及提取率等效果[22]。王金梅等[23]在研究超聲波輔助酶法提取草魚皮膠原蛋白工藝中，對比了經過超聲波處理和沒有經過處理下酶法提取得到的膠原蛋白的理化性質，結果經聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulface polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠電泳和傅里葉紅外光譜分析證明了超聲波處理不會對膠原蛋白的結構產生影響。由于魚類膠原蛋白變性溫度較低，膠原蛋白的三螺旋結構易被破壞而失去生理功能，所以在超聲波處理過程中需要控制超聲波的工作時間間隔以達到降低溫度的目的。

1.6.2 微波輔助法

微波技術的原理：微波技術具有一定的破壁作用，能夠產生高壓，強局部熱處理能夠讓膠原蛋白的三維螺旋結構變得更加的疏松，可以提供更多的酶解位點，使酶解反應進行更順利，使膠原蛋白更容易溶出，從而提高提取率[24]。張聯英等[25]采用微波技術處理鯽魚、鱸魚等的魚皮提取魚皮中的膠原蛋白，提高了膠原蛋白的提取率。微波輔助技術也存在著一定的弊端，當微波處理時間過長時會導致部分蛋白質損失，當處理時間過短時，破壁效果達不到最好，所以采用微波輔助時需要合理掌握微波處理時間才能夠獲得最佳的處理效果。

2 魚皮膠原蛋白的性質

2.1 結構分析

目前已經發現的膠原蛋白類型有29種，其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅴ型膠原蛋白呈纖維狀[26]。從魚皮中提取得到的膠原蛋白類型主要是Ⅰ型膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白分子長度約300 nm，直徑約1.5 nm，占生物體膠原蛋白總量的80%～90%，是一種天然高分子水膠體[27]。目前研究者通常采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜、紫外可見光譜分析、差示掃描量熱法和X射線衍射等方法對從魚皮中提取的膠原蛋白進行結構表征。廖偉等[28]采用SDS-PAGE凝膠電泳圖分析尖吻鱸魚皮膠原蛋白的結構特征，結果表明尖吻鱸魚皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。Wang等[29]采用SDS-PAGE凝膠電泳和紅外光譜分析鱘魚皮膠原蛋白的特征，SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，由2條α1鏈和1條α2鏈組成，膠原蛋白的紅外吸收光譜證實了膠原蛋白的三螺旋結構的完整性。

2.2 熱穩定性

膠原蛋白對溫度敏感，當溫度過高時會發生蛋白質變性，變性的臨界溫度為熱變性溫度。膠原蛋白的變性是指其三螺旋結構發生變化被破壞形成無規則的結構，從而導致膠原蛋白的性質發生變化，從不同魚類中提取的膠原蛋白的熱穩定性不同，與物種所生存的環境、羥脯氨酸和脯氨酸含量密切相關，羥脯氨酸和脯氨酸含量越高，膠原蛋白的熱穩定性越好，熱變性溫度越高，這是因為羥脯氨酸和脯氨酸夠促進肽鏈間氫鍵的形成，氫鍵在維持膠原蛋白三螺旋結構的穩定性中發揮著重要的作用[30-32]。羥脯氨酸的含量取決于不同的魚類物種和其原棲息地的水溫，所以從不同的物種中提取得到的膠原蛋白的熱變性溫度不同。Zhang等[33]研究了從鱘魚皮中提取的膠原蛋白的熱穩定性，得到鱘魚皮膠原蛋白的熱變性溫度為28.5℃，最大轉變溫度為34.4℃。膠原蛋白的熱變性溫度與肽鏈的交聯作用有著緊密的關系，交聯越多，熱穩定性越好，熱變性溫度越高。并且膠原蛋白的熱穩定性對其應用與開發有著至關重要的作用。

2.3 溶解性

蛋白質的溶解性是其重要的功能特性之一，蛋白質產品的水溶性取決于蛋白質-水的相互作用。膠原蛋白的溶解度指的是所提取的膠原蛋白在某種指定的溶液中能夠溶解的最大程度，而且溶解性還在膠原蛋白的制備過程中起著不可替代作用。膠原蛋白的溶解性和其等電點有關，溶解性隨著pH值的變化而變化，當處于等電點時，其溶解性最低，遠離等電點時，溶解性逐漸升高[34]。王晴等[17]用不同的pH值來研究從羅非魚皮中提取得到的酶溶性膠原蛋白的溶解度，當pH值低于3，膠原蛋白溶解度達70%以上，當pH值超過3，溶解性能開始迅速下降，在中性條件時，溶解性能最低，大約為25%，因為在等電點時溶解度最低，所以羅非魚皮膠原蛋白的等電點為pH7左右。

3 魚皮膠原蛋白的應用

魚皮膠原蛋白類型多為I型膠原蛋白，具有獨特的氨基酸序列、結構和功能。在膠原蛋白類型中I型膠原蛋白最具有市場前景，因為它具有穩定的三螺旋結構和特殊的功能特性和理化性質，因此，廣泛應用于食品、生物醫學、化妝品等行業。

3.1 在食品中的應用

由于魚皮膠原蛋白具有乳化性、發泡性、凝膠特性、抗氧化性、抗高血糖、抗高血壓等特性，使得魚皮膠原蛋白在食品工業中應用廣泛。

3.1.1 保健品

魚皮膠原蛋白產品含豐富的氨基酸，并且能夠很好地被人體消化吸收，廣泛應用于保健食品中。膠原蛋白能降低甘油三酯和膽固醇，按照一定比例配制的膠原蛋白添加到食品中不僅可以降低人體體重和血脂，還可以補充大量的微量元素，提高人體免疫力[35]。Lu等[36]研究了用酶水解得到膠原蛋白之后，發現膠原蛋白具有較高的與鈣結合的能力，主要是因為氨基上的氮和羧基上的氧是Ca2+的主要結合位點。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，羥脯氨酸可以將血漿中的鈣運輸到骨細胞中產生作用，并且羥脯氨酸的含量越高，鈣的補充速度越快，所以保健品中含有大量的膠原蛋白不僅可以補鈣還可以增強鈣吸收能力。祝德義等[37]通過試驗研究了膠原蛋白水解物膠原蛋白多肽與鈣的結合效果，證明膠原多肽更容易吸收，所以膠原蛋白及其水解物均可制成對人體健康有益的口服液。

3.1.2 食品包裝材料

基于膠原蛋白的可食用薄膜和涂層已經被提出用于延長食品的貨架期。能夠食用并且可以自動降解的食品包裝材料已經成為新的研究趨勢。膠原蛋白分子因其獨特的三螺旋結構，能夠形成具有抗拉強度很大的纖維束，因此利用膠原蛋白制備的可食性膜不僅具備優良的膜機械性能、阻氧、阻水、阻油及保香、保鮮等功能，還有較高的營養價值。利用膠原蛋白可以制成腸衣用來包裝香腸等食物，還可用于制作膠囊、熱敏物質的微膠囊化等[38]。Fadini等[39]用水解膠原蛋白和可可油在蔗糖塑化條件下制備的可食性膜，可以替代蟲膠涂抹在巧克力上，起到良好的包裝作用。曲文娟等[40]研究膠原蛋白-殼聚糖膜對豬肉的保鮮作用，得出膜包裹處理可以顯著降低堿性含氮物質和細菌產生的數量以及減緩顏色的變化。

3.1.3 食品添加劑

人體內膠原蛋白的生成能力會隨著年齡的逐漸增加、不健康的飲食習慣和生活作息而降低，因此膠原蛋白已經被添加到各種食品中[41]。膠原蛋白作為食品添加劑加到食品中，可以改善腸的流變性和減少脂肪消耗。膠原蛋白水解物作為食品調味劑添加到食品中，不僅能提高食品中氨基酸的含量，還能改善食品的口感。王碧等[42]研究了膠原蛋白在羊乳中的作用，研究結果表明膠原蛋白添加到羊乳中，不僅提高了羊乳的乳化穩定效果，還促進了人體對羊乳中鈣的吸收，增強了人體的免疫功能。

3.2 在生物醫學中的應用

魚皮膠原蛋白具有優良的理化性能、生物相容性、低抗原性、高生物降解性、良好的機械性能、止血性能和細胞結合性能，作為一種越來越有價值的生物材料，在生物醫學領域受到了廣泛的關注[43]。

3.2.1 傷口愈合的應用

人真皮中的蛋白質中有70%～80%是膠原蛋白，所以它在皮膚傷口愈合中有著不可替代的作用。膠原蛋白為成纖維細胞增殖提供了一個良好的細胞外基質環境，可以誘導血小板凝固，影響細胞分化，有助于皮膚創傷部分的愈合[44]。近年來，許多研究報道了魚類膠原蛋白在生物醫學上的應用，研究證明魚類膠原蛋白有作為全層創面愈合皮膚替代品的潛力[45]。魚皮膠原蛋白膜由膠原蛋白添加其他天然功能性產物制成，膠原蛋白膜結構呈現多孔網狀結構且孔結構之間相互連通，其生物穩定性高、免疫反應少，因此在臨床應用中顯示出很大的潛力[46]。

3.2.2 手術材料的應用

在外科手術或者外傷處置當中，需要對創面或者血管進行縫合，用于縫合的手術線分為可吸收線和不可吸收線。不可吸收線就是不能夠被人體組織所吸收的手術線，需要在傷口愈合時進行拆線，有一定的弊端，可吸收線就是能夠被人體直接吸收的手術線，可吸收線是由膠原蛋白制成的手術縫合線，具有和天然材料制成的縫合線一樣的強度和彈性，不僅便于吸收而且還有止血的作用。尤其是在面部整形美容手術中，除了正確的縫合方法以外還需要合適的縫線，傳統的縫合線是滌綸帶針線，滌綸線的優點是有良好的強度張力、較小排異性，缺點是在拆線時腫脹的部位沒有辦法消退完全，常常使患者感到疼痛和恐懼，但是用膠原蛋白線縫合傷口，縫線幾天后會自動脫落，可以有效減輕患者的疼痛感[47]。

3.2.3 組織工程的應用

膠原蛋白因其具有良好的生物相容性、低抗原性、高生物降解性、良好的機械性能、止血性能和細胞結合性能，所以是組織工程應用的理想材料[48]。趙君[49]將從鰻鱺魚皮中提取的I型膠原蛋白作為原材料，通過交聯作構建組織工程角膜載體支架，評價角膜載體支架的理化性質，研究結果表明鰻鱺魚皮膠原蛋白所制備的組織工程角膜支架具有較好的理化性質，有望用于組織工程角膜的構建。然而魚皮膠原蛋白也存在著一定的缺點，例如機械強度低、降解速度快。為了改善魚皮膠原蛋白存在的缺點，研究者們將魚皮膠原蛋白與其他天然和合成材料進行改性和混合來提高降解速度、生物穩定性和機械性能，例如，殼聚糖顆粒加入使支架的降解速率得到了延長，改善了支架的力學性能[50]。

3.3 在化妝品中的應用

人體成纖維細胞的合成能力隨著機體年齡的增長逐漸下降，皮膚中的膠原蛋白也越來越少，膠原纖維發生聯固化，皮膚開始慢慢萎縮、汗腺分泌能力減弱、膠原纖維開始斷裂，最后導致皮膚變老，出現色斑、皺紋等。膠原蛋白具有特殊的三螺旋結構，可以有效地鎖住水分，并且膠原蛋白外側存在大量親水基團，因此具有比其他物質更高的保濕作用。所以將膠原蛋白作為活性物質用于化妝品中，不僅能夠良好地滋潤皮膚，并且還有一定的抗皺效果，這是由于該物質中含有的酪氨酸與皮膚中的酪氨酸有一定的競爭，使得人體內的酪氨酸酶與該物質中的酪氨酸結合，抑制了酪氨酸酶與人體內的酪氨酸結合，減少了黑色素的產生，與此同時增強了皮膚里面膠原蛋白的活性。蔡陽倫等[51]對提取的I型膠原蛋白的功能特性進行研究，結果表明，I型膠原蛋白的吸水性、保濕性等特性良好，可以應用于化妝品領域。

4 結語

我國擁有豐富的魚類資源，從魚皮中提取的膠原蛋白有較高的價值，不僅減少了在加工過程中的資源浪費和環境污染，而且大大提高了魚類產品的加工附加值，還可以根據魚膠原蛋白的不同理化特性將其應用于不同的行業，使魚類膠原蛋白具有良好的開發前景。但是魚皮膠原蛋白的熱穩定性較差，容易發生變性，從而改變其結構和性質，而且部分新型提取膠原蛋白的應用技術尚不完善，無法實現工業化生產，探索魚皮膠原蛋白的工業化生產技術和膠原蛋白的分離純化技術依然是今后研究的重要內容。