溴結構域和超末端結構域家族與哺乳動物生殖

文蘭，祝靜，高輝，張昌軍，刁紅錄*

(1.湖北醫藥學院附屬人民醫院生殖醫學中心，十堰 442000；2.湖北醫藥學院生物醫學工程學院，十堰 442000；3.湖北省生殖醫學臨床醫學研究中心，十堰 442000；4.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，十堰 442000)

溴結構域和超末端結構域(Bromodomain and extra-terminal domain，BET)家族成員是一類含有溴結構域的蛋白。溴結構域是一種由約110個氨基酸組成的，存在于真核生物中的保守蛋白質基序，是已知唯一可以結合乙?；嚢彼釟埢牡鞍踪|模塊，其在結構上具有4個α-螺旋和2個環，可與組蛋白和其他蛋白質中的乙?；嚢彼釟埢Y合[1]。組蛋白乙?；墙M蛋白修飾的重要事件之一，BET能夠特異性的識別組蛋白上乙酰化的染色質位點，通過激活轉錄因子來促進基因的表達，對染色質結構和功能有重要的意義[2-3]。不僅如此，BET蛋白還可以作為蛋白質支架、有絲分裂標記、細胞周期調節因子和轉錄調節因子調節相關基因的轉錄與表達，發揮重要的生物學作用[4]。本文主要對BET家族在精子發生、胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)分化、胚胎發育及妊娠分娩中的作用進行綜述。

一、溴結構域和超末端結構域概述

BET家族由四名成員組成：溴結構域蛋白2(BRD2，又稱RING3和Fsrg1)、溴結構域蛋白3(BRD3，又稱Fsrg2和ORFX)、溴結構域蛋白4(BRD4，又稱Fsrg4、MCAP和HUNK1)以及睪丸特異性含溴結構域的蛋白(BRDT，又稱Fsrg3和BRD6)[5]。BETs包含兩個串聯的溴結構域和一個超末端結構域(ET)，其中溴結構域與染色質內的核小體相互作用，是BET蛋白調控基因轉錄所必需的；ET是一個由約80個氨基酸組成的保守結構域，通過招募特異性效應蛋白發揮調控功能[6]。此外，還有一個C端結構域，僅存在于BRD4和BRDT的兩個家族成員結構中，是招募正性轉錄延長因子b(Positive transcription elongation factor b，P-TEFb)所必需的結構。BETs可與位于“超級增強子”中的組蛋白上乙?；馁嚢彼峄蚧騿幼訁^結合，對基因轉錄進行表觀遺傳調控，與細胞生長、分化和炎癥密切相關。BETs屬于胞核蛋白，可以影響細胞的基因轉錄，參與DNA修復和調節細胞周期[7]。此外，溴結構域可以特異性識別乙酰化的賴氨酸，促進染色質開放，激活或暫停RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)復合物以促進或抑制轉錄延長，它的作用位點包括組蛋白H3上的乙?；嚢彼?4(H3K14ac)、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、非組蛋白如紅系核蛋白轉錄因子GATA-1、堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)類型的轉錄因子TWIST、RelA和信號傳導和轉錄激活因子3等[8]。BET與靶標分子相互作用的形成，為修飾染色質的效應子成功募集到啟動子和增強子奠定了基礎，支持組蛋白和轉錄因子乙?；淖R別[9-10]。綜上所述，BET通過其特殊的結構域識別乙?；馁嚢彼幔饔糜谔囟ǖ陌袠耍瑢θ旧|的轉錄調節功能進行調節。

二、BETs與哺乳動物生殖

1.BETs與精子發生：精子發生過程受睪丸生精小管調控，包括精原細胞增殖、精母細胞減數分裂和精子形成，是由精原細胞有絲分裂產生精母細胞，精母細胞通過減數分裂形成單倍體細胞群即精子細胞的過程[11]。四種BET基因都在成年哺乳動物的睪丸中表達，表達具有時空差異性。在小鼠中，BRD4在精原細胞中表達水平較高，BRD2在精原細胞中表達水平較低；但在精母細胞晚期和圓形精子細胞中BRD2表達水平最高，Brd3 mRNA在圓形精子細胞中有較高水平的表達；BRDT的第一個溴結構域(BD1)缺失會導致睪丸形態嚴重受損、精子形態嚴重缺陷、精子濃度降低；BRDT可以激活精母細胞進入第一次減數分裂時所需基因的細胞周期調節蛋白A1，當BRDT發生突變時會導致精母細胞減數分裂停止在前期，由此可見，BRDT是精子發生所必需的[1，5]。BRDT還可以作用于精母細胞減數分裂后乙酰化的染色質，并且只有在H4K5和H5K8同時乙?；那闆r下，BRDT的第一個溴結構域BD1才與組蛋白H4結合。由于H4K5和H4K8的乙?；歉咭阴；疕4的一個特征，因此，BRDT也是第一個被確定為可以鑒別高乙?；疕4的特異性因子。在減數分裂后期階段，精母細胞的細胞核體積會急劇減少，全基因組組蛋白移除，在此過程中，組蛋白首先會被過渡蛋白取代，隨后被魚精蛋白取代，這種取代與組蛋白H4的高乙酰化有關，因為當組蛋白H4高乙?；瘯r，染色質直接或者通過與BRDT等溴結構域蛋白的結合去促進組蛋白的移除。在精子細胞中組蛋白乙酰化和BRDT都可促進圓形精子細胞的激活，減數分裂后，BRDT與基因轉錄起始點上結合的喪失，與其在單倍體細胞中的表達減少有關[12]。此外，BRDT可以結合并識別生精細胞的減數分裂相關基因的轉錄起始位點上的乙?；M蛋白，從而激活減數分裂。當BRDT的溴結構域失去功能時，不能結合乙?；馁嚢彼幔蜁绊懭旧|的轉錄激活，改變精母細胞的正常染色質組織，影響染色體軸的長度[13]。BRD4在小鼠精子發生的減數分裂期和減數分裂后均可表達，精子發生過程中的染色質重組與頂體形成和組蛋白過度乙?；峭瑫r開始的，隨著組蛋白過度乙酰化，BRD4在精子細胞頂體底部的核膜上形成一個與頂體直接連在一起的環，但此環在頂體突變小鼠中不會形成。頂體突變的小鼠與人類球形精子癥患者高度相似，均表現出核壓實和生育缺陷，這是一種頂體畸形或缺失、精子頭部呈圓形、染色質壓實異常的情況，說明BRD4在整個精子發生的過程中發揮著重要的作用[14]。綜上所述，BRD4和BRDT在精子發生的過程中都發揮著重要的作用，尤其是BRDT，不僅在減數分裂的過程中高乙酰化組蛋白H4，還可以與基因轉錄起始點上乙酰化的組蛋白結合調節轉錄與調控，從而對減數分裂中基因激活以及精母細胞的染色質產生重要影響。

2.BETs與ESCs：ESCs主要依賴一組核心多能性轉錄因子來保持自我更新能力和細胞可塑性，這些細胞具有獨特的開放色質結構，在組蛋白的N端尾部有豐富的翻譯后修飾，這使得它們能夠維持高水平的轉錄活性[15]。在腫瘤中，BRD4以多種方式維持干細胞的多能性[16-17]。BRD4還可以維持ESCs的多能性以及干細胞基因的表達，敲除了Brd4基因的小鼠由于內細胞團的退化會發生胚胎致死，BRD2或BRD3沉默不影響ESCs集落形態或干細胞基因的表達，這說明BRD2和BRD3對于ESCs的維持不是必須的，而BRD4對于ESCs的維持至關重要[18-19]。BETs也在細胞周期進程和有絲分裂中發揮重要作用，BRD2、BRD3和BRD4在新合成的DNA上顯著富集。沉默了BRD2、BRD3或BRD4基因，S期細胞染色質上的增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)水平表達下調，BRD2、BRD3或BRD4的ET結構域會引起PCNA保留在S期染色質上，影響DNA的復制[19-20]。P-TEFb由細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶9(CDK9)和細胞周期蛋白亞基組成，可以磷酸化RNA Pol Ⅱ的C末端結構域的色氨酸，BRD4與組蛋白修飾劑、染色質重塑劑和P-TEFb相互作用，從而暫停和開始轉錄延伸的過程[21-22]。此外，ESCs的分化過程中，組蛋白H3和H4的乙酰化整體性減少，這表明組蛋白乙?；贓SCs多能性的維持中起著重要作用。有研究表明，BET蛋白抑制劑JQ1可以抑制BET的BD活性，從而導致ESCs核心轉錄因子Nanog表達下調，而且與BRD2和BRD3相比，BRD4與JQ1的結合力更強[18]。在Brd4基因敲除小鼠中，ESCs的形態分化增強，Nanog表達水平下調，這說明BRD4可以識別乙?；疕4K16，調節Nanog啟動子的轉錄活動，因此，BRD4抑制劑JQ1對ESCs的作用可能主要是通過抑制其與Nanog啟動子內乙?；M蛋白的結合來介導的[23-24]。所以說，BRD4通過識別H4K16ac與ESCs的Nanog啟動子相互作用，進而維持Nanog的表達，從而影響ESCs的干細胞基因的表達與多能性。

3.BETs與胚胎發育：胚胎發育是從受精卵發育成胚胎，再由胚胎發育成胎兒，直至娩出的過程。在小鼠妊娠中期(胚胎發育至13.5 d)時，BRD2在胚胎的大腦中表達最高，Brd2缺失的小鼠，其胚胎大小整體性減小，大腦發育缺陷；Brd4缺失會引起小鼠內細胞團的退化導致胚胎在著床前死亡[25-26]。所以，Brd2和Brd4基因敲除的小鼠都會出現使胚胎發育異常。BRD2是賴氨酸乙酰轉移酶7(Lysine acetyltransferase，KAT7)向核糖體RNA(rRNA)位點募集所必需的載體，也可以增強組蛋白H4乙酰化。小鼠Ly-1抗體反應克隆基因(Rattus norvegicus Ly1 antibody reactive，Lyar)mRNA可在早期胚胎的未成熟精母細胞和睪丸中檢測到，Lyar可與BRD2-KAT7復合物結合，加速組蛋白H4和組蛋白H3乙?；⑶彝ㄟ^BRD2增強KAT7和BRD4向rDNA募集，促進rRNA的合成，使rRNA上調，rRNA合成的調節是促進包括人ESCs在內的各種類型干細胞分化的一個重要因素，由此可知，BRD2可以調節早期胚胎中ESCs的發育[27]。此外，有研究表明BRDT蛋白在整個精子核中都能被檢測到，在精子核的早期分解過程中，殘留的BRDT可能與這些保留的組蛋白相互作用，并參與調節早期父系基因胚層特異性轉錄子基因的轉錄，對胚胎發育產生一定的影響[1]。綜上所述，BRD2可以影響小鼠胚胎器官的發育，BRD4卻影響小鼠內細胞團的進化，總之這些研究表明，盡管相關BET家族成員的基本結構是保守的，但它們在哺乳動物胚胎發育中的功能是多樣的，對胚胎發育具有重要意義。

4.BETs與妊娠分娩：多項研究結果表明BETs可以結合乙?；旧|，調節細胞增殖和炎癥免疫過程，并且在妊娠與分娩的過程中發揮著重要的作用[28-31]。子宮肌層激活是分娩的正常過程，它是通過肌肉收縮相關蛋白如催產素受體(Oxytocin receptor，OXTR)、間隙連接蛋白(Connexin 43，CX43)、前列腺素內過氧化物合成酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)和前列腺素F2α受體(Prostaglandin F2 alpha Receptor，PTGFR)的作用而發生的。前列腺素F2α(Prostaglandin F2 alpha，PGF2α)通過PTGFR發出信號，也可以通過上調這些收縮相關蛋白的表達，刺激子宮肌層細胞的促炎性細胞因子和趨化因子來參與分娩的準備[32]。BET蛋白抑制劑JQ1顯著降低了OXTR、PTGS2和PTGFRmRNA的表達以及PGF2α分泌，Brd2敲低可導致OXTR的表達降低，Brd4敲低會導致PTGFR表達降低，Brd3和Brd4同時敲低可導致PGF2α表達降低，說明BET蛋白可以誘導炎性信號，使肌層細胞轉變為收縮狀態[31]。因此，BET蛋白可以通過對OXTR、PTGF、RPGF2α的調控在分娩過程中發揮重要的作用。NF-κB信號通路參與分娩過程中促炎性的調節[33]，BET蛋白則通過結合并激活NF-κB族中RELA蛋白來促進炎癥[34-35]。因此，BET蛋白可以通過支持NF-κB調控轉錄對炎性反應及分娩相關介質發揮作用，從而利于調節哺乳動物的妊娠分娩。

三、展望

在組蛋白修飾中，賴氨酸乙酰化修飾已被廣泛研究，組蛋白乙?；梢杂绊懭旧|結構和DNA的功能，從而調節轉錄、DNA復制和修復，以及細胞周期的進展。在哺乳動物生殖的領域中，BETs蛋白對于精子發生、胚胎發育以及妊娠分娩都有著重要的影響，這對染色質的結構和胚胎發育過程中表觀遺傳控制的主要標記基因的表達及相關機制具有十分重要的研究意義，同時也為胚胎著床、胚胎發育以及不孕不育的發生機制提供新的科學理論參考和治療策略。