基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌的作用機(jī)制△

黃洪，張燕，張志娜，張寧，吳志斌，王定雪，王鏡輝，葉濤

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550002

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2藥劑科，3腫瘤科，4康復(fù)科，貴陽(yáng) 550001

胃癌發(fā)病率居中國(guó)惡性腫瘤第三位，2020年新發(fā)病例數(shù)、病死例數(shù)均位居全球第一[1]。胃癌發(fā)病因素多且復(fù)雜，患者多伴有慢性胃病史、家族遺傳史，主要由生活壓力過(guò)大、飲食不規(guī)律等生活因素造成，患者大多表現(xiàn)為體重急劇下降，上腹疼痛，伴有乏力、便血等癥狀[2-3]。中醫(yī)胃癌屬于胃脘痛、噎膈、積聚等，臨床常用黃芪-人參藥對(duì)治療腫瘤后期正氣虧損、氣陰兩傷、脾胃受損，可達(dá)到補(bǔ)氣養(yǎng)血扶正的目的，可改善患者的生活質(zhì)量。研究顯示及對(duì)國(guó)醫(yī)大師劉尚義教授臨床用藥規(guī)律總結(jié)發(fā)現(xiàn)，黃芪-人參藥對(duì)對(duì)原發(fā)性胃癌或胃癌放化療后癥狀改善及身體機(jī)能恢復(fù)方面療效顯著，但具體的機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究[4]。近年來(lái)，中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)多用于探討中藥的有效化學(xué)成分、通過(guò)靶點(diǎn)治療疾病的作用機(jī)制、構(gòu)建蛋白質(zhì)-配體之間相互作用的分子對(duì)接，可將中藥方劑治療疾病的機(jī)理可視化。因此，本研究運(yùn)用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，探討黃芪-人參藥對(duì)中的有效活性成分、靶點(diǎn)及其治療胃癌的作用機(jī)制，為臨床醫(yī)師臨證用藥提供一定參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分和靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中分別輸入關(guān)鍵詞“黃芪”“人參”，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性化合物的篩選條件，篩選出具有較高活性的化合物，再利用Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白名稱，通過(guò)Perl得到藥物有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 胃癌相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在 DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中以“gastric cancer”“stomach cancer”為關(guān)鍵詞篩選出“胃惡性腫瘤”和“胃腺癌”兩個(gè)文件，通過(guò)整合得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

將藥物的共同靶點(diǎn)和胃癌相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)Venny 2.1.0軟件得到黃芪-人參藥對(duì)作用于胃癌的重要靶點(diǎn)，再將重要靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)站，以Homo sapiens為篩選條件，將置信度設(shè)定為＞0.50，隱藏圖中孤立的蛋白質(zhì)，最后輸出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)靶標(biāo)蛋白關(guān)聯(lián)頻次。獲取蛋白PPI信息，通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件可視化圖形進(jìn)行研究分析，并根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)靶標(biāo)蛋白關(guān)聯(lián)頻次。

1.4 基因本位（gene ontology，GO）注釋富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將獲得的靶點(diǎn)蛋白代入R語(yǔ)言進(jìn)行基因代碼轉(zhuǎn)換，獲得靶點(diǎn)蛋白的entrezID，最后進(jìn)行GO注釋富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)置P＜0.05，采用R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 黃芪-人參藥對(duì)的有效活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪-人參藥對(duì)的有效成分、重要靶點(diǎn)代入Cytoscape 3.7.1建立有效活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化。

1.6 有效活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

將有效活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)靠前的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和最可能發(fā)揮作用的有效活性成分篩選出來(lái)，導(dǎo)入AutoDock Vina和Pymol軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，構(gòu)建配體和蛋白質(zhì)的分子對(duì)接直觀圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出20個(gè)黃芪有效活性化合物、22個(gè)人參有效活性化合物，通過(guò)Perl數(shù)據(jù)處理獲取黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分的作用靶點(diǎn)141個(gè)。

2.2 胃癌相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)輸入“gastric cancer”“stomach cancer”關(guān)鍵詞篩選出“胃惡性腫瘤”和“胃腺癌”兩個(gè)文件，整合得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，最終合并、刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共篩選出3817個(gè)重要靶點(diǎn)，通過(guò)Venny 2.1.0網(wǎng)站獲得黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分靶點(diǎn)蛋白與胃癌靶點(diǎn)蛋白的交集，二者疊加后獲得141個(gè)相互作用靶點(diǎn)。

2.3 黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)中藥組分、單味藥成分、藥物靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)間的關(guān)系，將黃芪-人參藥對(duì)的有效活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，使有效活性成分與靶點(diǎn)間的關(guān)系達(dá)到可視化，以探究黃芪-人參藥對(duì)的藥理學(xué)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，輸出的網(wǎng)絡(luò)圖中包含了175個(gè)節(jié)點(diǎn)，663條邊，其中不同顏色、形狀的節(jié)點(diǎn)分別表示藥物名稱、有效活性成分、靶點(diǎn)、胃癌，其中紫色圓形節(jié)點(diǎn)表示黃芪-人參藥對(duì)發(fā)揮抗胃癌作用的141個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，淡紅色V形節(jié)點(diǎn)表示黃芪-人參藥對(duì)的有效活性成分，橙色六邊形節(jié)點(diǎn)表示黃芪-人參藥對(duì)的藥物名稱，綠色菱形節(jié)點(diǎn)表示胃癌，若某一蛋白對(duì)某條通路具有調(diào)節(jié)作用，則通過(guò)邊連接。說(shuō)明黃芪-人參藥對(duì)可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮胃癌治療的作用。（圖1）

圖1 黃芪-人參藥對(duì)的藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將2.3中的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)站，構(gòu)建黃芪-人參藥對(duì)靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置置信度＞0.50，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)包含99個(gè)節(jié)點(diǎn)，614條邊，平均Degree為12.4，篩選得到靠前的10個(gè)靶點(diǎn)蛋白，分別為雄激素受體（androgen receptor，AR）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、促分裂原活化的蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、RB轉(zhuǎn)錄輔抑制因子1（RB transcriptional corepressor 1，RB1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、核受體輔激活蛋白1（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、p65、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶 1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）。（圖2）

圖2 黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO注釋富集分析和KEGG通路富集分析

GO注釋富集分析將黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌涉及的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分的前20條富集信息制成氣泡圖（圖3），其中生物過(guò)程主要集中于細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖應(yīng)答（圖3A），分子功能主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（圖3B），細(xì)胞成分主要集中于膜筏、膜微域、膜區(qū)（圖3C）。KEGG通路富集分析將篩選出前20條信號(hào)通路制成氣泡圖，其中最顯著的5條通路分別為脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體激活、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染（圖4）。

圖3 黃芪-人參藥對(duì)的GO注釋富集分析

圖4 黃芪-人參藥對(duì)的KEGG通路富集分析

2.6 核心活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

將篩選排名靠前的10個(gè)核心靶點(diǎn)（AR、HSP90AA1、MAPK1、RB1、ESR1、NCOA1、RELA、AKT1、EGFR、Bcl-2）與篩選得到排名靠前的6個(gè)有效核心成分（山奈酚、異鼠李素、芒柄花素、毛蕊花素、槲皮素、人參皂苷Rh2）進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的藥物分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，分子對(duì)接結(jié)果顯示，6大有效核心成分與前10個(gè)核心靶點(diǎn)具有廣泛的結(jié)合活性，其中AR-山奈酚、HSP90AA1-芒柄花素、MAPK1-人參皂苷Rh2、RB1-山奈酚、ESR1-山奈酚、NCOA1-槲皮素、RELA-異鼠李素、AKT1-毛蕊花素、EGFR-毛蕊花素、Bcl-2-山奈酚間的結(jié)合活性最顯著（表1）。

表1 核心活性成分-靶點(diǎn)分子的結(jié)合活性（kcal/mol）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為胃癌是由長(zhǎng)期飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞倦內(nèi)傷或感受外來(lái)邪毒，引起機(jī)體陰陽(yáng)平衡失調(diào)、臟腑經(jīng)絡(luò)功能失常，出現(xiàn)食滯、痰結(jié)、邪毒內(nèi)蘊(yùn)等病理性改變，最終形成腫瘤。中藥黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效；人參味甘，偏寒，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、除邪氣等功效；兩藥合用，益氣健脾。國(guó)醫(yī)大師劉尚義教授常將黃芪-人參藥對(duì)用于治療腫瘤后期正氣虧損、氣陰兩傷、脾胃受損[5]。張仲景用具體的治療案例證實(shí)，人參補(bǔ)氣固元之力最專，是治療陽(yáng)脫的專用藥[6]；黃芪具有補(bǔ)氣通陽(yáng)、養(yǎng)血活血的功效，是治療慢性虛癥的專用藥。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究也表明，含有中藥黃芪、人參的方劑能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆、侵襲和遷移能力，能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[7]。黃芪、人參配伍可提高機(jī)體免疫力進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤、抗腦缺血再灌注損傷等的目的[8]。在治療胃癌時(shí)，張翼[9]和李杰等[10]研究結(jié)果顯示，黃芪-人參藥對(duì)治療晚期胃癌的臨床療效優(yōu)于西藥聯(lián)合治療，表明中藥湯劑不僅以去瘤為主，還兼顧提高機(jī)體免疫力，從整體觀念治療，標(biāo)本兼顧。但黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌的分子作用機(jī)制尚未明確，為此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究方法進(jìn)一步探討黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路。

本研究最終預(yù)測(cè)得到黃芪-人參藥對(duì)共有31個(gè)有效化學(xué)活性分子及141個(gè)作用于胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)PPI篩選出黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌前10個(gè)最相關(guān)的候選靶點(diǎn)，分別為AR、HSP90AA1、MAPK1、RB1、ESR1、NCOA1、RELA、AKT1、EGFR、Bcl-2。其中，ESR1和AR與細(xì)胞周期阻斷、遺傳畸變、基因表達(dá)的調(diào)控、腫瘤相關(guān)生物功能和通路有關(guān)[11-12]。有研究對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示，胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中HSP90AA1基因不僅在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均上調(diào)，還在原發(fā)性胃癌中表達(dá)上調(diào)[13-14]。治療胃癌時(shí)，可通過(guò)抑制長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）ZNRD1-AS1靶向HSP90AA1軸來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。研究發(fā)現(xiàn)，促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的常見(jiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，MAPK1還可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此治療時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK1的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖[16-18]。Jiang等[19]研究表明，抑癌基因MAPK1-109aa通過(guò)與絲裂原活化蛋白激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)抑制MAPK1的磷酸化，從而抑制MAPK1及其下游因子在MAPK通路中的激活，并得出了circMAPK1可作為胃癌預(yù)測(cè)因子的結(jié)論。Umeda等[20]研究顯示，F(xiàn)raser細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合亞基 1（Fraser extracellular matrix complex subunit 1，F(xiàn)RAS1）是胃癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，F(xiàn)RAS1可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路來(lái)影響RB1基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制胃癌的肝轉(zhuǎn)移。同時(shí)，RB1也能預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移[21]。此外，胃癌細(xì)胞中經(jīng)常受到管制的miRNA-215可通過(guò)瞄準(zhǔn)RB1基因來(lái)影響細(xì)胞增殖，進(jìn)而預(yù)防胃癌的發(fā)生以實(shí)現(xiàn)治療的目的[22]。由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)黃芪-人參藥對(duì)有效活性成分及對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-人參藥對(duì)中的核心靶點(diǎn)對(duì)胃癌細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，治療時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)上述靶點(diǎn)基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)GO注釋富集分析結(jié)果分別篩選出黃芪-人參藥對(duì)治療胃癌涉及的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分的前20條富集信息，黃芪-人參藥對(duì)的化學(xué)成分主要通過(guò)脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體激活、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路等發(fā)揮作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，黃芪-人參藥對(duì)中的有效活性分子可以改善胃癌患者的近期癥狀、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[23]。

由分子對(duì)接結(jié)果來(lái)看，AR-山奈酚、HSP90AA1-芒柄花素、MAPK1-人參皂苷Rh2、RB1-山奈酚、ESR1-山奈酚、NCOA1-槲皮素、RELA-異鼠李素、AKT1-毛蕊花素、EGFR-毛蕊花素、Bcl-2-山奈酚間均有較好的結(jié)合活性。Kim等[24]、Zhang和Ma[25]的研究表明，山奈酚可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的自噬和凋亡，并激活了從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的肌醇依賴酶l（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）-應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-C/Ebp-同源蛋白質(zhì)（C/Ebp-homologous protein，CHOP）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a可抑制胃癌細(xì)胞中的自噬細(xì)胞死亡。同時(shí)，使用含有山奈酚成分的藥物也能抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[26]。槲皮素是一種黃酮類化合物，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用可以增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效[27-28]。本研究結(jié)果可以為臨床用藥提供更有力的參考。

綜上所述，黃芪-人參藥對(duì)中的有效活性成分可以改善胃癌患者的近期癥狀并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療胃癌的目的，為黃芪、人參的臨床應(yīng)用提供了理論支持，對(duì)臨床有一定的參考價(jià)值。