泉州地區女性基因多態性與乳腺癌相關性研究

陳紫萱 王青蘭 蔣燕成 陳德波 張志珊

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國女性乳腺癌患者的發病率和病死率逐年上升，根據國家癌癥中心發布的《2018年全國最新癌癥報告》，僅在2014年，中國女性癌癥每年新發病例為27.89 萬例，在女性惡性腫瘤中占比為16.51%，死亡病例為6.6 萬例，在女性惡性腫瘤死亡占比為7.82%[1]。臨床上，乳腺癌的復發和轉移是導致患者治療失敗和死亡的主要原因，而乳腺癌細胞主要在血管和淋巴管的微環境中，通過某些分子定向導航，黏附，進行轉移。這類小分子主要由組織細胞、炎性細胞產生，通過與相應受體結合后產生跨膜信號，趨化腫瘤細胞定向移動，故稱之為趨化因子。因此，有研究提出“趨化因子受體”模型，用來解釋腫瘤細胞歸巢于特定器官的情況。基于第一個半胱氨酸殘基位置，趨化因子可分為4 個亞家族，分別為 CXC、CC、C 和 CX3C ，分別與嗜中性粒細胞和單核細胞以及淋巴細胞趨化性相關。CXC 成員中的CXC 趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12），亦稱為基質細胞衍生因子1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），位于人類染色體10q11.1 上，幾乎在所有器官的免疫細胞、成纖維細胞和上皮細胞中廣泛表達。目前研究發現，CXCL12（SDF-1）、調節活化正常T 細胞表達與分泌的趨化因子2（C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2，monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、CXC 趨化因子配體18（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8，interleukin 8，IL-8）等多種趨化因子與乳腺癌的病理生理機制相關[2-4]。臨床病理分析、體內外實驗都發現這些趨化因子對乳腺癌的發生、增殖、侵襲和轉移具有促進作用[5-8]。隨著診斷方式的發展和進步，乳腺癌患者的存活率有了明顯提升，但是診斷為晚期的患者，存活率僅為27%左右。考慮到腫瘤治療復發、轉移的異質性，常用的診療指標并不適用于所有患者，需要有更為個性化的檢測指標。近年來，相關研究發現趨化因子及其受體的基因多態性與乳腺癌的發生發展有關[9-12]。因此，本研究檢測CXCL12（SDF-1）、CCL2（MCP-1）、CXCL8（IL-8）趨化因子的基因型分布，并進一步探討其與乳腺癌的相關性及臨床病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1—12月在福建省泉州市第一醫院就診的乳腺癌患者150 例，均為女性，年齡26～70 歲，平均（55.3±8.9）歲，設為病例組。其組織病理學確診為原發性乳腺癌，未行放、化療及內分泌治療。根據臨床分期標準，將150 例乳腺癌患者分為4 期，其中Ⅰ期46 例、Ⅱ期36 例、Ⅲ期39 例、Ⅳ期29 例。同一時間收集在本院體檢的健康女職工150 名，年齡29～60歲，平均（51.4±8.0）歲，設為對照組。兩組患者一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05），可對比。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 試劑與儀器

全血基因組核酸提取試劑盒[西安天隆科技有限公司，Ex-DNA 全血基因組Ⅲ代，20 T/盒（預封裝），5 T/板×4 板]，引物和PCR 試劑均為生工生物工程（上海）股份有限公司產品，Big Dye 測序反應試劑盒（96 孔板、8 孔聯管，美國，ABI 公司）。核酸提取儀（NP968-S，西安天隆科技有限公司）。BioTeke 濃度檢測儀（北京百泰克生物技術有限公司）。PCR 擴增儀22331（德國，Eppendorf 公司）。ABI 3500Dx 基因測序儀（美國，ABI 公司）。

1.3 方法

根據說明書步驟提取患者外周血DNA ；使用BioTeke濃度檢測儀檢測DNA 濃度及純度。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。見表1。反應條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，58℃30 s，72 ℃45 s 共35 個循環，72 ℃延伸5 min。測序PCR 產物經純化后上樣至ABI 3500Dx 基因測序儀進行核苷酸序列測定。測序結果用Chromas 軟件進行分析。

表1 CXCL12、CCL2、CXCL8 引物序列

1.4 觀察指標

（1）觀察CXCL12、CCL2、CXCL8 基因頻率的哈溫平衡；（2）CXCL12、CCL2、CXCL8 基因型分布與乳腺癌發病風險的相關性；（3）CXCL12、CXCL8 基因多態性與臨床病理特征的關系。文章中體現了中國乳腺癌篩查與早診早治指南、中國乳腺癌篩查與早期診斷指南、乳腺癌診療指南的臨床參考或執行標準。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行分析。判斷病例組和對照組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，采用擬合優度χ2檢驗。兩組間等位基因頻率進行非條件Logistic 回歸分析各基因型與乳腺癌發病風險的相關性。采用χ2檢驗分析其與臨床病理的關系。

2 結果

2.1 數據符合Hardy-Weinberg 平衡

用病例組和對照組各基因型表達的實際頻率與期待頻率做χ2檢驗，驗證結果各組均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），各數據均具有群體代表性，可用于病例-對照組研究。見表2。

表2 CXCL12、CCL2、CXCL8 基因頻率的哈溫平衡

2.2 CXCL12、CCL2、CXCL8 基因型分布與乳腺癌發病風險的相關性

結果顯示，CXCL12 基因GA 型基因頻率在兩組間差異有統計學意義，進一步分析在超顯性模型下，GA 型女性患乳腺癌的風險低于GG 和AA 型（OR=0.589，95%CI：0.369～0.938，P=0.026）。CXCL8 等位基因A 和T 的頻率在兩組間有統計學差異（P=0.000），A 基因患乳腺癌的危險度相對較低，在顯性和隱性模型中同樣均顯示出T 基因的患癌風險增加。CCL2 基因在不同遺傳模型下病例組和對照組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 CXCL12、CCL2、CXCL8 基因多態性與乳腺癌發病風險的相關性[例（%）]

表3（續）

表3（續）

表3（續）

表3（續）

表3（續）

2.3 CXCL12、CXCL8 基因多態性與臨床病理特征的關系

從表4、表5結果顯示，CXCL12 超顯性遺傳模型中GA、GG+AA 與乳腺癌淋巴結轉移、腫瘤大小相關（P=0.009、P=0.008）。CXCL8 在顯性遺傳模型中與臨床病理特征無相關，在隱性模型中由于AA 基因型在乳腺癌中所占比例較低，存在差異性較大，故不做統計學分析。

表4 CXCL12 基因多態性與乳腺癌臨床病理特征的關系[例（%）]

表5 CXCL8 基因多態性與乳腺癌臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

近年來，全基因組關聯性分析（genome-wide association study，GWAS）[14]通過對多種腫瘤進行相關的基因多態性研究，從而發現影響疾病發生、預后及治療的遺傳變異因素。趨化因子屬于小型細胞因子樣蛋白的超家族，通過與G 蛋白偶聯受體相互作用而誘導細胞骨架重新排列和內皮細胞定向遷移，近年來CXCL12/CXCL8 被證實在腫瘤轉移模型中顯示出有效作用。乳腺癌患者容易發生腋窩淋巴結轉移、骨轉移、肝轉移等，而在皮膚轉移、腎轉移則較為少見，這種相對特異性的轉移方式背后的原因較多，其中“歸巢理論”認為人體器官會產生趨化因子，若表達趨化因子受體的癌細胞，在經過富含趨化因子器官的血管壁被捕獲并增殖，就會出現組織和器官的特異性轉移。作為CC 類趨化因子的一種，CCL2 被認為與乳腺癌惡性程度和病程相關。

既往研究表明，CXCL12 遺傳變異與多種惡性腫瘤密切相關，本研究中分析趨化因子CXCL12、CCL2、CXCL8 基因的3 個SNP 位點（rs1 801 157、rs1 024 611、rs4 073）與乳腺癌的關聯性。其中CXCL12（rs1 801 157）多態性是研究最多的變異，位于3’非翻譯區 801 位點G/A，結果顯示，CXCL12 基因GA 型基因頻率在兩組間差異有統計學意義，進一步分析在超顯性模型下，GA 型女性患乳腺癌的風險低于GG 和AA 型（OR=0.589，95%CI：0.369～0.938，P=0.026）。這與LIN 等[15]研究結果相一致。

傳統腫瘤解剖病理分期（包括淋巴結轉移數目、遠處轉移情況、腫瘤大小）是臨床上較成熟的風險評估指標，在此基礎上2011年St.Gallen 國際研討會[13]將分子分型作為乳腺癌患者的主要治療方式達成共識。本次在臨床病理研究中發現該基因多態性與乳腺癌淋巴結轉移、腫瘤大小相關。CXCL8 在人染色體4q13～q21 區域，由4 個外顯子、3 個內含子和1 個啟動子構成，在炎癥和免疫調節方面有重要作用。CXCL8 由中性粒細胞產生，可誘導細胞運動和有絲分裂，促進癌癥進展和轉移，CXCL8（rs4 073）位于啟動子-251 位點A/T，有研究發現[16]，CXCL8-251A/T 和+781C/T 多態性與其轉錄活性有關，影響疾病進展。已有多項研究表明，CXCL8-251A/T 多態性與多種癌癥風險相關，如腦膠質瘤、胃癌、前列腺癌等，這可能是因為CXCL8-251A/T 的高蛋白表達與炎性反應相關，長期炎性反應則促進了疾病的發展。CXCL8-251A/T 的A 等位基因與IL-8 的蛋白表達高于T 等位基因相關，本研究發現CXCL8 等位基因A 和T 的頻率在兩組間有統計學差異（P=0.000），T 基因患乳腺癌的危險度相對較高，但與臨床病理特征無相關。

CCL2 由巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞產生，可刺激單核細胞/ 巨噬細胞和其他炎性細胞趨化，已被證實與癌癥風險之間存在相關性。CCL2（rs1 024 611）位于5’端調控區-2518 位點G/A，可以影響血漿CCL2 濃度，被認為是癌癥相關危險因素。從過往研究來看，不同種群之間結果差異也較大，同時也受到不同癌種的影響。有研究認為CCL2-2581G/A 在亞洲人中相關性更高，在高加索人種中則不存在相關性。本次研究結果來看，CCL2 基因在不同遺傳模型下病例組和對照組間基因型頻率的差異均無統計學意義，考慮這種結果差異與人種有關，本研究人群為福建省泉州地區女性，種族之間存在差異性，但是否明確為本原因所致，還需要進一步的實驗研究來證實。

綜上所述，CXCL12、CXCL8 基因多態性與泉州地區乳腺癌女性患者之間存在一定的相關性，與CCL2 基因則不存在相關性。